Почему поглощение метиленового синего изменяется с концентрацией

Возьмите один исходный флакон метиленового синего и налейте две порции в стаканы. Первый заполните исходным раствором, второй — десятикратным разбавлением. Второй стакан будет светлее, как и ожидается. Но если посмотреть внимательнее, изменилось кое-что ещё. Изменился оттенок. Один раствор имеет более чистый небесно-синий цвет, а другой — синевато-фиолетовый оттенок. Разбавление сделало больше, чем просто уменьшило интенсивность. Оно изменило то, какой химический вид отвечает за основную часть поглощения.

Идея, лежащая в основе этого сдвига, проста. Растворённый метиленовый синий не является одним видом частиц. Одиночный катион красителя, называемый мономером, может укладываться лицом к лицу со вторым катионом, образуя димер, а димеры могут объединяться в более крупные агрегаты. Каждая форма имеет собственный спектр поглощения. То, что показывает спектрофотометр, является суммой для смеси, находящейся в этой кювете при данных условиях. Измените смесь — и спектр сместится, даже если общее содержание красителя изменяется по прямому коэффициенту разбавления.

Мономер и димер являются разными поглощающими частицами

Представьте мономер как плоскую карту с положительным зарядом, распределённым по её кольцевой системе. Две такие карты могут лежать одна поверх другой. Положительные заряды отталкиваются, но плоские ароматические поверхности притягиваются благодаря взаимодействиям укладки, а окружающая вода и противоионы экранируют отталкивание. В результате образуется связанная пара с общими электронными состояниями. Её разрешённые переходы находятся при большей энергии, чем переход мономера, поэтому полоса димера появляется при меньшей длине волны, чем полоса мономера, а более крупные агрегаты дополнительно вносят вклад в синюю область в виде плеча.

При очень низкой концентрации в чистой воде преобладают мономеры, и доминирует длинноволновая полоса. При увеличении общей концентрации связанная форма занимает всё большую долю, и коротковолновая полоса растёт относительно первой. Поэтому соотношение двух полос отражает состав смеси, а не общую концентрацию напрямую. Одно измерение на одной длине волны не может разделить две формы без предположения о том, какая форма присутствует.

Именно поэтому эталонные спектры всегда должны сопровождаться условиями. Спектральный эталон для метиленового синего содержит положения полос с указанием растворителя, солевого фона, pH, температуры и диапазона концентраций, при которых они были получены. Указание пика без этих условий оставляет число неопределённым. Две лаборатории могут одновременно получать корректные результаты для разных спектров одного и того же красителя, потому что они измеряли разные смеси.

Что изменяет равновесие

Концентрация является главным фактором. Для образования димера необходимо, чтобы встретились два мономера, поэтому его доля растёт быстрее, чем линейно с общей концентрацией красителя. Измеренные константы димеризации в воде находятся на уровне тысяч на моль при комнатной температуре, поэтому доля димера резко увеличивается в микромолярном диапазоне. Глобальная аппроксимация, охватывающая диапазон от микромолярных до миллимолярных концентраций, показала наличие вклада тетрамеров уже ниже 34 микромоляр, что предупреждает о невозможности строгой двухкомпонентной модели при десятках микромоляр. Точные доли зависят от среды, поэтому эта статья описывает направления изменений, а не универсальную таблицу преобразований.

Соль является вторым фактором. Растворённые ионы экранируют отталкивание между двумя катионами, поэтому добавление хлорида натрия и подобных электролитов смещает смесь к димерам и агрегатам при той же концентрации красителя. Этот эффект виден в исследованиях агрегации метиленового синего в солевых и водных средах, где краситель от примерно 1 микромоляра до 3,4 миллимоляра измеряли при содержании хлорида натрия от 0 до 0,15 моляра. В этой модели доля тетрамера достигала примерно 0,93 при высоких значениях красителя и соли. Поэтому спектр, записанный в воде, и спектр, записанный в физиологическом солевом растворе, не являются взаимозаменяемыми стандартами.

Температура действует в противоположную сторону. Укладка высвобождает связанную воду и противодействует тепловому движению, поэтому нагревание раствора обычно диссоциирует часть димеров обратно в мономеры, тогда как охлаждение способствует ассоциации. Рассчитанная энтальпия диссоциации является отрицательной, около минус 30 килоджоулей на моль в диапазоне от 282 до 333 кельвинов, что подтверждает экзотермический характер ассоциации. Холодный образец, только что вынутый из холодильника, может выглядеть более агрегированным, чем тот же образец после установления равновесия при комнатной температуре.

Растворитель задаёт исходные условия. Вода благодаря сильному гидрофобному эффекту способствует укладке плоских катионов красителя. Спирты, такие как этанол и метанол, лучше сольватируют кольца и разрушают агрегаты, поэтому при одинаковой концентрации красителя он выглядит более мономерным в этаноле, чем в воде. Апротонные сорастворители действуют аналогично: в смесях воды и DMSO при 293 кельвинах добавление DMSO подавляло димеризацию, что указывает на роль структуры воды как движущей силы укладки. С поверхностно-активными веществами требуется осторожность в обоих направлениях. Выше их критической концентрации мицеллообразования мицеллы могут солюбилизировать мономеры индивидуально и возвращать спектр, похожий на мономерный. Ниже этой точки противоположно заряженное поверхностно-активное вещество может, наоборот, способствовать укладке: при 100 микромолярном красителе индуцированная SDS полимеризация достигала максимума около 4 миллимоляр SDS, примерно половины точки мицеллообразования, до перераспределения при более высоких уровнях поверхностно-активного вещества. Работа по эффектам краситель-растворитель и организованных сред на спектры метиленового синего показывает, насколько сильно непосредственное молекулярное окружение, а не только объёмная концентрация, определяет наблюдаемые полосы.

pH имеет значение главным образом на крайних значениях. В диапазоне около нейтрального pH, используемом в большинстве лабораторных работ, метиленовый синий сохраняет привычную катионную синюю форму, и агрегация определяет основную часть спектральной картины. Сильная кислота или основание, окислительно-восстановительная химия, приводящая к бесцветной лейкоформе, или связывание с белками и частицами добавляют состояния за пределами пары мономер-димер. Если спектр изменяется после добавления буфера, проверьте состав буфера на наличие солевых и связывающих компонентов, прежде чем связывать всё только с pH. Справочник по химии и протонированию отделяет вопросы идентичности формы от вопроса агрегации, рассматриваемого здесь.

Почему прямая линия Бера — Ламберта искривляется

Соотношение Бера — Ламберта говорит, что оптическая плотность равна коэффициенту поглощения, умноженному на концентрацию и длину оптического пути. Это закон подсчёта. Он предполагает, что подсчитываемые объекты остаются одинаковыми при изменении их количества: один поглощающий вид, фиксированный спектр, отсутствие химических изменений с концентрацией, монохроматический падающий свет, отсутствие рассеяния или повторного излучения и прохождение света через указанную длину пути.

Агрегация нарушает первое допущение. Формально общее поглощение остаётся суммой по видам: длина пути, умноженная на коэффициент поглощения каждого вида и его собственную концентрацию. Каждый вид подчиняется закону. Смесь — нет, потому что концентрации видов являются нелинейными функциями общей концентрации красителя. Поэтому калибровочная зависимость поглощения в области полосы мономера от общего содержания красителя начинается как прямая в разбавленном пределе и изгибается вниз при росте концентрации, поскольку каждое дополнительное количество даёт пропорционально меньше мономера. Кривая, измеренная на полосе димера, изгибается в другую сторону. Исследования агрегации указывают именно этот механизм как источник наблюдаемых отклонений от закона Бера — Ламберта. Подгонка прямой через искривлённую область и экстраполяция за её пределы являются стандартной ошибкой. Линия действительна только в диапазоне и матрице, для которых она была построена.

Разбавление создаёт связанную с этим ловушку. Разбавление концентрированного исходного раствора для попадания в диапазон прибора не сохраняет соотношение видов. Разбавленная кювета повторно устанавливает равновесие в сторону мономера, поэтому её спектр правильно описывает разбавленный образец и неправильно описывает исходный концентрат. Обратный расчёт спектра исходного раствора путём масштабирования оптической плотности восстанавливает оценку общего содержания только в том случае, если калибровка уже учитывает этот сдвиг. Он никогда не восстанавливает исходную форму полос. Любое сравнение спектра концентрата с разбавленным эталоном является сравнением двух разных смесей.

Длина оптического пути является частью результата

Оптическая плотность масштабируется расстоянием, которое свет проходит через образец. Кювета 10 мм даёт в десять раз большую оптическую плотность, чем кювета 1 мм с тем же раствором. Такое масштабирование точно только для одного и того же раствора, и при агрегации это уточнение имеет решающее значение.

На практике длина пути является инструментом для сохранения измерений в допустимом диапазоне. Большая длина пути обеспечивает чувствительность для разбавленных, преимущественно мономерных растворов. Короткая длина пути удерживает концентрированный образец в диапазоне без большого разбавления, которое сбросило бы равновесие. Программа исследования агрегации, лежащая в основе приведённых выше чисел, использовала именно такой подход: ячейки 1 сантиметр для красителя от 1,1 до 34 микромоляр и 0,01 сантиметра для диапазона от 94 микромоляр до 3,4 миллимоляр. Микрообъёмные платформы и планшетные считыватели добавляют собственную геометрию, включая короткие и иногда изменяющиеся пути, а также поверхности, где катионный краситель может адсорбироваться. Указывайте длину пути вместе с числом так же, как спектральный эталон указывает растворитель и соль. Оптическая плотность без длины пути — это не результат. Это слух.

Дисциплина измерений следует из механизма. Перед измерением доводите образцы до одной температуры. Используйте один и тот же тип кювет и ориентацию, согласованные холостые пробы с тем же солевым и буферным фоном и чистую посуду, поскольку метиленовый синий адсорбируется на стекле и пластике, а окрашенная кювета сохраняет память о предыдущем концентрированном образце. Измеряйте быстро после приготовления, когда важна кинетика агрегации, и создавайте каждую калибровочную кривую в той же матрице и с той же длиной пути, что и для неизвестных образцов. Для визуальной проверки помните, что глаз является плохим спектрометром. Вопрос о том, может ли цвет раствора установить чистоту, является отдельным и имеет отрицательный ответ, а сдвиги оттенка из-за агрегации являются одной из причин.

Диаграмма, которую стоит держать рядом с прибором

На рисунке ниже статья сжата в один лабораторный справочник. Три раствора содержат один и тот же краситель, но отличаются общей концентрацией и солевым фоном. Их схематические спектры показывают, как длинноволновая полоса мономера уступает долю коротковолновой полосе димера при усилении укладки. Условия напечатаны на рисунке, потому что без них кривые нельзя повторно использовать. Для измеренных положений полос при указанных условиях используйте спектральный эталон. Для того, как краситель попадает в клетки после растворения, см. вход в клетки через восстановление и распределение. Для того, как доза света и геометрия дополнительно формируют фотохимические измерения, см. воздействие света и геометрия измерений.