Может ли метиленовый синий обходить митохондриальный комплекс III? Почему исследования расходятся

Две лаборатории изучали, может ли метиленовый синий обходить заблокированный митохондриальный комплекс III. Одна ответила: нет. Другая: да. У обеих были данные.

Первое исследование на митохондриях мозга мышей показало, что краситель не может этого делать. Второе, на митохондриях мозга трёх видов грызунов, показало, что частично может. Третье исследование, на печени мышей, часто цитируется рядом, но проверяло другой вопрос. Если оставить его на своём месте, половина путаницы исчезает.

Нет единого механизма, который можно объявить доказанным для всех условий. Есть три эксперимента с разными блокаторами, дозами и показателями. Сначала нужно изучить условия. Затем следуют выводы.

Что здесь означает обход

Электроны входят в цепь через комплекс I (от NADH) или комплекс II (от сукцината), проходят через комплекс III к цитохрому c, затем через комплекс IV к кислороду. Созданный при этом градиент клетка использует для производства ATP.

Утверждение об обходе означает, что метиленовый синий забирает электроны выше места блокировки и передаёт их ниже. Окисленный краситель принимает электроны от NADH или ранних компонентов цепи, превращаясь в лейкометиленовый синий, а восстановленная форма передаёт их цитохрому c или обратно в цепь. Если передача происходит ниже блока, дыхание и мембранный потенциал частично восстанавливаются. Если передача происходит на уровне блока или выше него, восстановление не происходит.

Одна деталь комплекса III определяет большую часть этого спора. Комплекс работает через Q-цикл с двумя сайтами связывания ингибиторов. Антимицин связывается с сайтом Qi. Миксотиазол связывается с сайтом Qo. Исследование только с одним из них проверяет только половину комплекса.

Исследование первое: отсутствие обхода в митохондриях мозга мышей

Gureev и коллеги использовали митохондрии коры мозга мышей C57BL/6, выделенные с помощью дигитонина, при концентрации 0,1 мг белка на мл. Субстраты охватывали три режима: пируват плюс малат по 5 мМ каждого, сукцинат 10 мМ с глутаматом 2 мМ и L-пролин 10 мМ. Блокаторы: ротенон 1 микромоль и антимицин 1 микрограмм на мл. Дозы красителя составляли 0,5, 1 и 2 микромоль, при этом основной концентрацией была 1 микромоль. Методы и графики представлены в сообщении FEBS Letters.

Обход комплекса I работал. Ротенон снижал стимулированное ADP дыхание примерно со 121 до примерно 2 нмоль в минуту на мг, а 1 микромоль красителя восстанавливал его примерно до 21. Мембранный потенциал восстанавливался на пирувате с малатом и на L-пролине.

Обход комплекса III не работал. Антимицин снижал дыхание примерно до 16, а краситель изменял показатель только примерно до 20. Мембранный потенциал не восстанавливался ни с одним субстратом даже при дозах красителя до 5 микромоль. Данные по перекиси показывали то же: один краситель увеличивал выделение перекиси с базового уровня около 76 пмоль в минуту на мг до примерно 1170, 1460 и 1945 при трёх дозах, однако антимицин снижал этот вызванный красителем сигнал примерно на 25, 88 и 96 процентов соответственно. Если восстановленный краситель напрямую реагировал бы с кислородом, блокирование комплекса III не должно было бы подавлять сигнал. Авторы сделали вывод, что восстановленный краситель окисляется в сайте Qo комплекса III, выше блока антимицином. Коротко: доноры передают электроны красителю, краситель — Qo, далее идёт обычный путь. Ротенон обходится. Антимицин — нет.

Исследование второе: частичный обход у трёх видов, в обоих сайтах ингибирования

Svab и коллеги расширили дизайн. Они использовали митохондрии мозга мышей, крыс и морских свинок, выделенные градиентом Percoll, при той же концентрации 0,1 мг/мл, с пируватом плюс малатом или глутаматом плюс малатом по 5 мМ каждого. Они применяли два блокатора комплекса III: антимицин A 0,3 микромоль и миксотиазол 1 микромоль. В большинстве анализов использовали 2 микромоль красителя, в исследованиях цитохрома c — 0,5. Все три вида с одинаковыми протоколами описаны в статье открытого доступа.

Оба блока частично обходились у всех трёх видов. В митохондриях мышей антимицин подавлял дыхание, а краситель повышал его примерно на 60 процентов — примерно с 37 до 59 нмоль в минуту на мг. Миксотиазол подавлял его на 88 процентов, примерно до 4,5, а краситель увеличивал показатель примерно в пять раз — до 23. Мембранный потенциал частично восстанавливался при обоих ингибиторах, что измерялось двумя красителями (сафранином O и ратиометрическим TMRM) для исключения оптических артефактов.

Это исследование также напрямую проверяло передачу, чего первое исследование не делало. Экзогенный ацетилированный цитохром c в концентрации 25 микромоль не восстанавливался энергизированными митохондриями с ингибиторами или без них, но добавление красителя вызывало восстановление в обоих случаях. В бесклеточном буфере NADH плюс краситель восстанавливали цитохром c со скоростью, пропорциональной NADH. Более длинный путь: восстановительные эквиваленты передаются красителю, краситель напрямую передаёт их цитохрому c, комплекс IV передаёт их кислороду. Этот путь полностью пропускает комплекс III, поэтому оба блокатора могут обходиться.

Два дополнительных показателя поддерживают такую интерпретацию. Флуоресценция NAD(P)H снижалась после добавления красителя к обработанным миксотиазолом митохондриям, что означает отток восстановительных эквивалентов через новый путь. Кроме того, поглощение красителя при 660 нм отслеживало каждое добавление, а центрифугированные супернатанты показывали более чем стократное накопление окисленного красителя внутри энергизированных митохондрий, после чего он уходил при разрушении потенциала. Протонная энергетика также согласуется: пропуск этапов перекачки оставляет примерно 2 протона на пару электронов вместо 10, поэтому более быстрое потребление кислорода при только частичном восстановлении потенциала соответствует настоящему обходу, а не является доказательством его отсутствия.

Та же подготовка дала результаты, которые делают поверхностное чтение ошибочным. При ингибиторе плюс красителе ADP снижал дыхание вместо повышения, а блокирование транспорта стимулировало его вместо замедления, при этом мембранный потенциал изменялся в обычных направлениях. В этой системе одно только потребление кислорода вводит в заблуждение.

Исследование третье: исследование печени, проверявшее комплексы I и II, а не III

Lee и Boelsterli использовали митохондрии печени мышей и культивируемые гепатоциты, повреждённые эфавирензом (комплекс I, IC50 около 30 микромоль) и гидразином, метаболитом изониазида (комплекс II, IC50 около 30 микромоль). Краситель примерно 30 микромоль восстанавливал окисление NADH, мембранный потенциал и ATP, одновременно снижая окислители и некротическую гибель. В статье Redox Biology это описывается как перенос красителем электронов вокруг повреждённых комплексов I и II.

Этот результат является установленным контекстом для верхней части цепи и ничего не говорит о комплексе III, поскольку там ничего не блокировалось. Он не может подтвердить или опровергнуть ни одно из двух исследований мозга.

Матрица условий

Четыре причины, почему оба исследования комплекса III могут быть правы в своих условиях

1. Блокатор был разным вмешательством. Только антимицин 1 микрограмм на мл против антимyцина 0,3 микромоль плюс отдельный блокатор сайта Qo. Путь красителя через сайт Qo не работает там, где работает прямой путь к цитохрому c. Один сайт нельзя использовать как замену обоим.

2. Отличались доза красителя и время измерения. Основные концентрации 1 против 2 микромоль в системе редокс-цикла, где поглощение и прямая редукция цитохрома c зависят от концентрации и времени. Небольшие различия дозы и времени измерения могут выявить разные части одной сети.

3. Отличались препараты. Выделение дигитонином против выделения градиентом Percoll выбирает частично совпадающие, но не идентичные популяции митохондрий. Концентрация белка была одинаковой — 0,1 мг/мл, поэтому эта переменная исключается, но различия субпопуляций и целостности остаются. А подозрение на видовую разницу было устранено: вторая группа воспроизвела свой результат и на мышах.

4. Состояние субстрата определяет, что может сделать краситель. Три режима субстрата против пар, связанных с NADH. Доступность NADH и мембранный потенциал вместе определяют скорость восстановления красителя и его распределение, а путь, требующий восстановленного красителя рядом с окисленным цитохромом c, зависит от этого выбора.

Как читать следующее утверждение об обходе

Нужно спрашивать, какой комплекс был заблокирован, каким ингибитором, в каком сайте и какой дозе. Нужно учитывать концентрацию красителя и момент измерения. Нужно учитывать ткань, вид, выделение, концентрацию белка и субстрат. И нужно проверять, согласуются ли потенциал, дыхание, редокс-состояние и прямой анализ передачи, потому что одно только потребление кислорода здесь неоднократно показывало неверное направление.

Краткий вывод остаётся прежним. Обход красителем комплекса I признан. Вокруг комплекса III митохондрии мышей с антимицином 1 микрограмм на мл и красителем 1 микромоль показывают отсутствие функционального обхода, тогда как три вида с антимицином 0,3 микромоль или миксотиазолом 1 микромоль и красителем 2 микромоль показывают частичный обход с прямой передачей краситель → цитохром c. Эти утверждения совместимы. Всё более широкое утверждение является экстраполяцией.

Связанные материалы сохраняют спорное утверждение внутри установленной химии: как метиленовый синий перемещает электроны о переносе, эксперименты по обходу комплекса I об установленном верхнем пути, измерения мембранного потенциала и их артефакты о том, почему потребовались два красителя, и лабораторная работа с редокс-циклами о ловушках дозирования и времени.