Метиленовый синий при травме мозга: понимание доклинических данных

Удар по голове, закупоренная артерия и медленно развивающееся нейродегенеративное заболевание могут завершиться одной и той же жалобой: мозг больше не располагает достаточной энергией для выполнения своей работы. Именно эта общая конечная точка объясняет, почему одно соединение постоянно появляется во всех трех направлениях исследований. Но общая конечная точка не означает общую концепцию. Лечение, назначенное до травмы, лечение, назначенное через час после нее, и показатели, измеренные через месяцы, проверяют разные идеи, даже если в шприце находится одна и та же синяя жидкость.

Эта статья посвящена части литературы, связанной с травмами. В ней рассматривается, что означает метиленовый синий при травме мозга в экспериментах на животных, проводится различие между травматическим повреждением, инсультом и хронической нейродегенерацией, а также объясняется, почему время введения дозы определяет большинство различий между исследованиями.

Три вида повреждений, один энергетический сбой

Механизм, связывающий эти модели, находится внутри митохондрий. В норме электроны проходят по дыхательной цепи для производства АТФ, а здоровая цепь удерживает активные формы кислорода под контролем. После повреждения части цепи дают сбой, выработка АТФ снижается, а образование свободных радикалов возрастает. Обзор Molecular Neurobiology за 2018 год описывает метиленовый синий как альтернативный переносчик электронов: он принимает электроны от NADH и передает их цитохрому c, что повышает активность комплекса IV и восстанавливает синтез АТФ даже при нарушении работы ранних участков цепи.

Приведенные числа конкретны. В клеточных препаратах и срезах активность комплекса IV повышалась на 30–100 процентов, а потребление кислорода возрастало пропорционально, что указывает на полезное использование дополнительных электронов, а не на их утечку с образованием радикалов. В модели инсульта у крыс производство АТФ в пораженной области было примерно на 30 процентов выше через 24 часа после лечения по сравнению с нелечеными животными. Обзор Biochemistry (Moscow) за 2022 год добавляет последующие эффекты: снижение окислительного стресса, уменьшение нейровоспаления, уменьшение апоптоза, а также влияние на моноаминоксидазу, синтазу оксида азота, митохондриальный биогенез, аутофагию и агрегацию неправильно свернутых белков.

Таким образом, концепция проста. Повреждение блокирует нормальный путь движения электронов, а метиленовый синий предлагает обходной маршрут. Все последующие вопросы сводятся к тому, какое повреждение рассматривается, когда вводится соединение и как измеряются результаты.

Травматическое повреждение — это не инсульт

В модели черепно-мозговой травмы сила воздействует одномоментно. Первичное повреждение является механическим: ткань разрывается, сосуды повреждаются, а гематоэнцефалический барьер открывается в течение минут. То, на что метиленовый синий теоретически может воздействовать, — это вторичная волна, которая развивается в течение часов и дней, когда митохондрии в сохранившейся ткани начинают работать хуже, воспаление распространяется, а отек нарастает. Конечные точки в этих исследованиях отражают эту последовательность: объем поражения, содержание воды в мозге, выживание нейронов рядом с зоной удара и последующее поведение, такое как восстановление двигательных функций или обучение в лабиринте.

В модели инсульта или глобальной ишемии характер воздействия противоположен. Кровоток прекращается, энергетический сбой возникает в течение минут, а восстановление кровотока создает собственное реперфузионное повреждение. Здесь введение дозы синхронизируется с сосудистым событием, часто в течение минут после окклюзии или реперфузии, а конечные точки оценивают судьбу острой ткани в течение часов или одного-двух дней: размер инфаркта, кровоток и раннее функциональное восстановление. Один из вариантов в литературе по инсульту — предварительное лечение, когда животным вводят соединение до окклюзии сосуда, что проверяет профилактику способом, который невозможно этично воспроизвести при травме головы у людей.

Результаты при инсульте являются наиболее выраженными в литературе о повреждениях и включают наиболее четкие отрицательные результаты. У крыс, получавших метиленовый синий при реперфузии после одного часа окклюзии средней мозговой артерии, размер инфаркта через 2 дня был на 30 процентов меньше, при этом больше ткани в зоне риска и зоне полутени было сохранено (Shen, 2013). Исследование с постоянной окклюзией показало более медленное превращение угрожаемой ткани в инфаркт, но не выявило уменьшения окончательного объема инфаркта через 24 часа при обеих проверенных дозах (Rodriguez, 2014). Третье исследование окклюзии уменьшило размер инфаркта примерно вдвое при средней дозе и напрямую оценило ультраструктуру митохондрий и митофагию в ишемическом мозге, одновременно сообщив о неочевидной детали: измеряемый апоптоз вырос, тогда как некроз снизился (Di, 2015). А при глобальной ишемии непрерывная инфузия низкой дозы восстановила активность цитохром c-оксидазы, уровни АТФ и мембранный потенциал митохондрий в уязвимой области гиппокампа CA1, сохранила эти нейроны и защитила пространственную память (Lu, 2016). Измерение CA1 заслуживает отдельного внимания: это прямые данные об АТФ и работе дыхательной цепи внутри поврежденного мозга, тогда как литература по ЧМТ в основном делает выводы на основе косвенных показателей.

Хроническая нейродегенерация отличается от обоих вариантов. В моделях болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона и болезни Хантингтона животным вводят соединения в течение недель или месяцев и измеряют агрегацию белков, обмен дофамина или постепенное ухудшение когнитивных функций. Эти конечные точки почти не имеют общего с поражением, измеряемым через несколько дней после удара. Читатели, переносящие результат из одной колонки в другую, перемещают данные через границу, которую эксперименты никогда не пересекали. Наше руководство по литературе о нейродегенерации сохраняет эти исследования с длительными временными рамками в отдельном контексте, а сравнение только данных по инсульту подробно разделяет исследования с закупоркой сосудов и исследования с ударным воздействием.

Что именно делали модели ЧМТ

Опубликованных исследований метиленового синего при черепно-мозговой травме у людей нет. Вся база данных по ЧМТ состоит из экспериментов на животных, преимущественно на крысах и мышах, и включает ограниченное число исследований, которые стоит рассмотреть отдельно, поскольку их детали различаются способами, которые теряются в кратких обзорах.

В первом контролируемом исследовании с кортикальным повреждением крысам вводили 1 мг/кг внутривенно через один час после легкого воздействия, затем 0,5 мг/кг через три часа (Watts, 2014). Объем поражения по МРТ оставался ниже у обработанных животных в течение двух недель наблюдения. Количество ошибок постановки лапы в тесте ходьбы значительно снизилось на 1, 2 и 7 дни, но не на 14 день. При микроскопическом исследовании на 14 день число дегенерирующих нейронов в поврежденной коре составило 270 против 368 на поле, а аномальное окрашивание по Нисслю — 41 против 73. Иными словами, ранняя защита с ослаблением поведенческого преимущества ко второй неделе.

В модели диффузного повреждения использовали срединную жидкостную перкуссию у мышей и однократную внутривенную дозу 2 мг/кг в течение получаса (Fenn, 2015). У обработанных животных наблюдалась более спокойная экспрессия воспалительных генов, меньше воспалительных микроглиальных клеток, менее выраженный отек и отсутствие депрессивноподобного поведения на 7 день. Не менее важны и отрицательные результаты: сама травма лишь умеренно увеличила содержание воды в мозге, а метиленовый синий не восстановил потерю массы тела или нарушение координации движений. Противовоспалительное действие не равно полной защите.

Два исследования на мышах использовали одну и ту же схему: 1 мг/кг через один час, 0,5 мг/кг через шесть часов, затем ежедневное введение в течение трех дней, и расширили механизм действия. В модели кортикального повреждения лечение уменьшило объем поражения через 24 часа, 72 часа и на 14 день, сохранив нейроны и повысив маркеры аутофагии (Zhao, 2016). В модели жидкостной перкуссии оно уменьшило апоптоз нейронов, укрепило нарушенный гематоэнцефалический барьер и улучшило неврологические показатели в течение двух недель (Shen, 2019). Однако содержание воды в мозге не отличалось через 72 часа в исследовании Zhao, а результаты ротарод-теста не отличались на 1 и 3 дни в исследовании Shen. Показатели поражения и выживания клеток изменялись, но отек и ранние двигательные показатели не всегда следовали той же тенденции.

Наиболее важным исследованием времени введения является эксперимент с отсроченным введением (Watts, 2016). Используя ту же модель воздействия, первую дозу отложили до 24 часов после травмы. Ко 2 дню группа с отсроченным введением показала уменьшение поражения, сопоставимое с животными, получившими лечение в первые часы, и этот эффект сохранялся на 7 и 14 дни. Поведенческий сигнал был слабее: улучшение по тесту ошибок постановки лапы в отсроченной группе было статистически незначимой тенденцией. Одна лаборатория, одна модель, одно 24-часовое окно. Это реальные данные о том, что окно может выходить за пределы первых часов, но это также весь объем доказательств для такого утверждения. Следует обратить внимание на ловушку в слове «отсроченный» в других местах: российская серия с названием о задержанной нейропротекции вводила дозу через 30 минут и использовала слово «отсроченный» для обозначения длительных результатов, а не позднего начала.

Небольшое исследование очагового повреждения у крыс завершает картину времени введения с другой стороны: дозирование непосредственно перед травмой и через 30 минут после нее оба уменьшали нарушение функций конечностей (Stelmashook, 2019). Предварительное введение работает в лаборатории именно потому, что лаборатория задает время травмы.

Контроль дозы здесь имеет значение. Обзоры описывают низкие дозы как стимулирующие митохондриальное дыхание, а высокие дозы — как ингибирующие, что соответствует той же двухфазной форме, наблюдаемой в фармакологии метиленового синего. Поэтому результаты нельзя интерпретировать как «больше синего — больше восстановления». Каждое исследование проверяет одну точку на кривой. Объяснение дозозависимости рассматривает эту кривую в разных моделях, а профиль безопасности и побочных эффектов описывает, что происходит при более высоких дозах.

Посмотрите на таблицу по горизонтали: одно и то же соединение, три разных временных шкалы. Профилактика относится к средней строке, немедленное лечение — к первым двум, а отсроченные результаты — к первой и третьей.

Профилактика, немедленное лечение, отсроченные результаты

Профилактику легче всего неправильно понять. В моделях ишемии животные, получившие дозу до окклюзии сосуда, показывают лучшие результаты, и этот факт иногда цитируется так, будто метиленовый синий защищает любой мозг от любого будущего повреждения. Это не следует из данных. Результат показывает, что митохондрии, подготовленные альтернативным путем переноса электронов, лучше переносят запланированное прекращение кровотока. Люди не планируют травмы головы.

Немедленное лечение — это область, где сосредоточены данные по ЧМТ. Введение в течение часов после удара направлено на вторичный каскад повреждения, пока он продолжается: энергетический сбой, окислительный стресс, воспаление, отек. Улучшение показателей поражения и отека в этом случае является реальным эффектом лечения, но это лечение процесса, а не восстановление разорванной ткани.

Отсроченные результаты — третья концепция. Поведение, измеренное через недели после травмы, или обмен белков, измеренный через месяцы в хронической модели, показывает, сохранилась ли ранняя защита или изменились ли медленные процессы. Меньшее поражение через 24 часа, статистически незначимая поведенческая тенденция после отсроченной на 24 часа дозы и улучшение в лабиринте через месяцы хронического введения — это три разных утверждения с разными требованиями к доказательствам, и только первое на данный момент подтверждено более чем один раз.

Что эти данные не могут показать

Все приведенные результаты имеют одну и ту же границу. Митохондрии грызунов реагируют на метиленовый синий способами, которые могут быть сходными с человеческими, но крыса, получившая внутривенную дозу через несколько минут после контролируемого удара, не является человеком, поступившим в отделение неотложной помощи через несколько часов после падения. Анестезия, контролируемая тяжесть повреждения, молодые здоровые животные и короткий период наблюдения огранич