Метиленовый синий и рассеянный склероз: что изучали исследования на животных

Поиск по теме метиленового синего при РС приводит к работам, которые выглядят так, будто отвечают на один и тот же вопрос. Это не так. В одной статье метиленовый синий давали больным мышам как лечение. В другой ни одно животное им не лечили. Там метиленовый синий использовали как синюю окраску тонких срезов спинного мозга, чтобы патологоанатом мог увидеть миелин под микроскопом.

Это основная идея всей статьи. Краситель имеет две роли в биологии, и кроме одной бутылки они не имеют ничего общего. Как кандидат в лекарственные средства он вводится живому животному, и вопрос заключается в том, изменяется ли течение заболевания. Как окрашивающее вещество он наносится на мертвую фиксированную ткань после эксперимента, и вопрос заключается в том, как выглядела ткань. Если не заметить это различие, раздел методов патологии можно прочитать так, будто он является результатом лечения.

Что такое EAE простыми словами

Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, обычно сокращаемый как EAE, является стандартной моделью животных для изучения отдельных аспектов рассеянного склероза. Исследователь иммунизирует восприимчивую мышь фрагментом белка миелина вместе с сильным адъювантом. Затем иммунная система начинает атаковать собственную центральную нервную систему животного. У мыши развивается восходящая слабость, которую легко оценивать по шкале от 0 до 5: от вялого хвоста до паралича задних конечностей.

Удобство такой оценки объясняет популярность EAE и одновременно показывает, почему модель может вводить в заблуждение. Человеческий РС возникает самостоятельно, включает более широкий и менее определенный набор мишеней и вызывает зрительные, сенсорные, когнитивные, мозжечковые и двигательные симптомы при рецидивирующем или прогрессирующем течении. EAE воспроизводит отдельные механизмы, такие как воспаление, демиелинизация и повреждение аксонов, в контролируемых условиях. Она не воспроизводит РС в миниатюре. Читатели, которым нужна общая схема, могут изучить, как предполагается действие метиленового синего на клеточном уровне, прежде чем оценивать отдельное утверждение о заболевании.

Две работы ниже также использовали разные антигены EAE, и это важно. В исследовании лечения заболевание вызывали с помощью MOG35-55 — короткого пептида из миелинового олигодендроцитарного гликопротеина. В исследовании патологии заболевание вызывали с помощью MP4 — слияния сегментов основного белка миелина и протеолипидного белка. Выбор штамма и антигена меняет расположение поражений и поведение воспаления, поэтому эти два исследования не являются двумя повторениями одного эксперимента.

Карта: модель → вопрос → ограничения

Держите эту таблицу открытой. Это исходная ссылка для этой статьи. Каждая строка показывает, на какой клинический вопрос может ответить модель, что фактически измерялось и где заканчивается возможность переноса результатов.

Каждый, кто проверяет следующий заголовок, может использовать те же столбцы вместе с как читать доклинические исследования: нужно спросить о виде животного и антигене, роли соединения, конечных точках и о том, является ли результат изменением течения заболевания или снимком ткани.

Результат лечения: что изменило введение вещества

Исследование лечения 2016 года в Journal of Neuroimmunology использовало самок мышей C57BL/6 возрастом около 8–10 недель, иммунизированных 250 микрограммами MOG35-55 на мышь. После индукции животные с EAE были случайным образом распределены в группу метиленового синего или группу EAE без лечения, а клинические оценки отслеживались примерно до 30-го дня.

Клинические оценки были значительно ниже у мышей, получавших лечение, чем у контрольных животных с EAE, с 15-го по 30-й день при P менее 0,01. Анализ спинного мозга показывал то же направление: у получавших лечение животных было меньше воспалительной инфильтрации, меньше демиелинизации и меньше потери аксонов.

Отличительной частью была панель сигнальных путей. Лечение увеличило активацию AMPK и экспрессию SIRT1 и подавило активацию NF-kB — центрального воспалительного переключателя. Со стороны адаптивного иммунитета оно уменьшило ответ Th17 и усилило ответ Treg. Таким образом, предполагаемая цепочка выглядит так: метиленовый синий → AMPK и SIRT1 → снижение сигнализации NF-kB → сдвиг от воспалительных Th17 к регуляторным Treg → более слабое повреждение тканей → более низкие оценки.

Эта цепочка является интерпретацией, а не доказанной причинной последовательностью. Исследование показывает, что препарат, изменения сигналов и улучшение заболевания происходят одновременно. Оно не доказывает, что AMPK и SIRT1 обеспечивают весь эффект, а публично индексируемый текст не содержит с достаточной ясностью точную дозу в миллиграммах на килограмм, путь введения, день начала или продолжительность, чтобы воспроизвести режим только по резюме. Любое число дозировки этого исследования, указанное на коммерческой странице, следует считать непроверенным, если оно не ссылается на полный раздел методов. Более широкий массив данных о метиленовом синем у людей — это место, где следует проверять, перерос ли этот ранний иммунный сигнал в клинические данные.

Результат патологии: что показали шесть месяцев исследования ткани

Исследование MP4 2015 года в PLoS ONE использовало самок мышей C57BL/6, иммунизированных 200 микрограммами MP4 в полном адъюванте Фрейнда плюс токсин коклюша в день иммунизации и повторно через 48 часов. Ни одно животное не получало метиленовый синий как лекарство. После фиксации и заливки срезы спинного мозга толщиной 1 микрометр окрашивали метиленовым синим для световой микроскопии, а электронную микроскопию проводили на вентролатеральном тракте для более детального анализа.

Ткань изучали на трех этапах: острый пик с 7 мышами, через три месяца после начала с 5 мышами и через шесть месяцев после начала с 10 мышами. Средние клинические оценки на этих этапах выглядели почти одинаково — около 1,7–1,8 по шкале от 0 до 5. Ткань показывала другую картину. Изолированное повреждение миелина выросло примерно с 569 000 волокон на квадратный миллиметр при остром пике до примерно 1 496 000 через шесть месяцев, причем сравнение острого и долгосрочного периода было значимым при P равном 0,027. Совокупное повреждение миелина и аксонов примерно удвоилось к шести месяцам. Ремелинизированные волокна оставались ниже одного процента на каждом этапе, что является сдерживающей деталью для ожиданий восстановления.

Повреждение аксонов имело U-образную картину: высоким при остром пике, ниже через три месяца и самым высоким через шесть месяцев, а также коррелировало с набуханием митохондрий и уменьшением расстояния между нейрофиламентами. Оценка проводилась вслепую относительно стадии и баллов, что усиливает вывод о том, что клинические оценки недооценивали продолжающееся структурное повреждение.

Именно это является главным вкладом исследования для читателя, интересующегося РС. Стабильная оценка инвалидизации не означала стабильную ткань. Это также показывает, почему эта работа не может подтверждать утверждение о лечении РС метиленовым синим. Она изучала время, а не лечение.

Почему ни одно исследование не устанавливает пользу для пациентов

Рассматривайте каждую работу как исследование, которое хорошо отвечает на узкий вопрос, но не отвечает на вопрос пациента.

Во-первых, различается причина. EAE специально запускается с помощью определенного антигена и адъюванта. Человеческий РС развивается самостоятельно с более широким иммунным набором, включающим T-клетки, B-клетки, врожденный иммунитет и резидентные глиальные клетки. Соединение, изменяющее MOG-зависимый ответ у мыши, не обязано изменять такой же более широкий человеческий ответ.

Во-вторых, различается фенотип. Восходящая слабость хвоста и задних конечностей у мыши — удобный показатель. Он сжимает разнообразие человеческого РС в одно двигательное число. Препараты регулярно изменяют краткосрочные оценки EAE, не меняя течение заболевания у людей, поэтому EAE является инструментом скрининга и изучения механизмов, а не миниатюрной клиникой.

В-третьих, остаются нерешенными вопросы воздействия и времени. Непрерывное раннее введение в 30-дневном эксперименте на мышах не является длительным пероральным применением у человека с уже существующим заболеванием, и ни одно из исследований не измеряло уровни вещества в нервной системе. Без этой связи нет перехода от концентрации на клеточной модели или дозы у мыши к человеческой схеме применения.

В-четвертых, эти две работы не являются воспроизведением друг друга. Разные антигены, разные вопросы, разные конечные точки, и в одном случае вообще не было лечения. Объединять их как два положительных исследования лечения РС — это ошибка категорий.

Что это означает для читателей, оценивающих доказательства

В этих исследованиях не существует установленного протокола применения метиленового синего при РС. Исследование лечения поддерживает дальнейшее изучение AMPK, SIRT1, NF-kB и баланса Th17 и Treg в MOG EAE. Исследование патологии напоминает, что повреждение ткани может продолжаться, когда оценки выглядят стабильными, и что метиленовый синий в разделе методов иногда означает банку с красителем, а не лекарственный препарат. Читателям, следящим за текущими исследованиями рассеянного склероза, следует помнить о различии между красителем и лекарством. Вопросы безопасности, включая риски для крови и взаимодействия, следует обсуждать с врачом вместе с общими данными о безопасности метиленового синего до того, как делать выводы на основе лабораторных заголовков.

Итог можно выразить одним предложением. Одно цитируемое исследование вводило метиленовый синий мышам с MOG EAE и сообщало о более легком течении заболевания с противовоспалительным сдвигом иммунного ответа, тогда как другое цитируемое исследование ничего не вводило и использовало метиленовый синий только для окрашивания спинного мозга при документировании накопления повреждения миелина и аксонов в течение шести месяцев, поэтому эти две работы не устанавливают, что метиленовый синий помогает при РС у людей.