Альтернативы метиленовому синему для микроскопии

Для простой окраски бактериального мазка кристаллический фиолетовый может заменить метиленовый синий, если задача состоит в том, чтобы увидеть форму клеток. Для живых клеток лучшей альтернативой может оказаться фазово-контрастная микроскопия вообще без красителя. Выбор зависит от того, какое наблюдение необходимо провести.

Представьте, что два человека исследуют одну и ту же бактериальную культуру. Один хочет отличить палочковидные клетки от округлых. Другой хочет выяснить, погубила ли обработка бактерии. Краситель, который дает первому четкое изображение, может не дать второму никакого пригодного ответа.

Прежде чем выбирать замену, закончите предложение: «Мне нужно наблюдать ___ в ___, и клетки должны / не должны оставаться живыми». Это предложение определяет задачу, которую должен выполнять метод окрашивания.

Начните с образца и исследовательского вопроса

Сначала определите, должны ли клетки оставаться живыми, а затем — какую характеристику необходимо наблюдать:

Клетки должны оставаться живыми: для наблюдения движения или формы рассмотрите фазово-контрастную микроскопию без окрашивания или DIC; для ядерной ДНК — Hoechst 33342 с флуоресцентной микроскопией; для оценки целостности мембран выберите валидированный анализ, например SYTO 9 с йодидом пропидия.
Клеткам не обязательно оставаться живыми: для морфологии бактерий рассмотрите простую окраску кристаллическим фиолетовым или негативную окраску нигрозином; для реакции по Граму используйте полный метод окрашивания по Граму; для ядерной ДНК в фиксированных клетках рассмотрите флуоресцентную окраску DAPI.

Используйте эту таблицу, чтобы сравнить ограничения каждого варианта. Это выбор методов, а не инструкция по замене одного флакона другим в уже существующем протоколе.

Что необходимо наблюдать	Образец и оборудование	Возможная альтернатива	Основное ограничение
Форма и расположение бактерий	Подготовленный бактериальный мазок; светлое поле	Простая окраска кристаллическим фиолетовым	Показывает морфологию; не позволяет установить реакцию по Граму или жизнеспособность.
Контуры клеток на темном фоне	Бактериологический препарат; светлое поле	Негативная окраска нигрозином	Метод подготовки и состав реагента имеют значение; неокрашенная клетка не обязательно жива.
Реакция по Граму	Подготовленный бактериальный мазок; светлое поле	Полный метод окрашивания по Граму	Требует полной последовательности реагентов и контрольных образцов.
Движение или изменения в живых клетках	Совместимый влажный препарат; фазовый контраст или DIC	Без окрашивания	Требуется подходящая оптика; контраст не идентифицирует конкретную молекулу.
Ядерная ДНК	Фиксированные клетки; флуоресценция	DAPI	Требуются совместимые фильтры возбуждения и эмиссии.
Ядерная ДНК в живых клетках	Живые клетки; флуоресценция	Hoechst 33342	Проникновение в клетку не означает, что условия визуализации безвредны.
Целостность бактериальной мембраны	Нефиксированные бактерии; флуоресценция	SYTO 9 с йодидом пропидия	Окрашивание мембран является косвенным показателем жизнеспособности.

Для простого мазка заменяйте метод осторожно

Кристаллический фиолетовый — практичный вариант, когда задача состоит в получении одноцветного изображения морфологии бактерий. В Bacteriological Analytical Manual FDA приведены два состава кристаллического фиолетового, подходящих для простой окраски. Используйте документированный состав и соответствующий способ приготовления; одного названия красителя недостаточно для определения рабочего реагента.

Кристаллический фиолетовый также используется при окрашивании по Граму, но простая окраска кристаллическим фиолетовым от этого не становится окрашиванием по Граму. В протоколе окрашивания по Граму ASM дифференциальный результат зависит от последовательного действия кристаллического фиолетового, йода, обесцвечивания и контрастного окрашивания. Если исключить эти этапы, изменится то, какие выводы можно сделать по изображению. Различие рассматривается подробнее в статье простая окраска и окрашивание по Граму.

Нигрозин позволяет выявлять контуры другим способом: он затемняет фон, тогда как бактериальные клетки остаются сравнительно светлыми. В инструкции Merck по нигрозину есть важная деталь, которую легко упустить в общем перечне заменителей. Указанный рабочий состав содержит формальдегид. Поэтому из слов «негативная окраска» нельзя делать вывод о совместимости с живыми клетками, даже если сами клетки выглядят неокрашенными. Проверяйте полный состав реагента и способ подготовки образца.

Для живых образцов рассмотрите изменение оптики

Если вы хотите наблюдать, как клетки движутся или делятся, введение дополнительного красителя может усложнить наблюдение. Как объясняет Nikon в руководстве по контрасту прозрачных образцов, фазовый контраст и дифференциально-интерференционный контраст, или DIC, делают образцы видимыми за счет различий в их оптических свойствах. Эти методы позволяют наблюдать живые неокрашенные клетки при наличии необходимых компонентов микроскопа.

Такой выбор позволяет сохранить препарат неокрашенным, но меняет доступную информацию. Можно отслеживать границу клетки или ее движение, не зная, какая именно молекула создала контраст. Если задача заключается в локализации молекул, вместо этого выберите подходящий метод мечения.

Для ядерной ДНК в сравнении красителей DAPI и Hoechst от Invitrogen проводится различие между распространенным применением DAPI для фиксированных клеток и более проникающим в клетки Hoechst 33342, который предпочтителен для мечения живых клеток. Для обоих требуется флуоресцентное оборудование. Ни один из них не является прямой заменой цветного красителя для светлопольной микроскопии.

Рассматривайте воздействие красителя и освещение как экспериментальные условия. Если измеряемым параметром является поведение клеток, сравнивайте окрашенные и неокрашенные препараты.

Красная клетка не обязательно мертва

SYTO 9 и йодид пропидия часто используют совместно для оценки целостности бактериальной мембраны. В руководстве BacLight неповрежденные мембраны связываются с зеленым окрашиванием, а поврежденные — с красным. Для конкретного образца такую интерпретацию необходимо валидировать.

Проблему иллюстрирует исследование Rosenberg и коллег 2019 года. В 24-часовых биопленках E. coli на стекле в фосфатно-солевом буфере около 96% клеток in situ выглядели положительными по йодиду пропидия. Однако авторы оценили, что после сбора материала 82% клеток были культивируемыми. Конфокальные изображения показывали клетки с зеленым содержимым под окрашенным в красный материалом, что указывало на вклад внеклеточных нуклеиновых кислот в вводящий в заблуждение сигнал.

Эти процентные значения относятся к разным измерениям на препаратах из данного исследования и не являются универсальным поправочным коэффициентом. Практический вывод состоит в том, чтобы проверять источник сигнала. В биопленке краситель нуклеиновых кислот может выявлять материал как вне клеток, так и внутри поврежденных клеток. Для вывода о жизнеспособности исследователи рекомендуют использовать дополнительные измерения, например культивирование или метаболическую активность, признавая при этом ограничения каждого метода.

Проверяйте фактический состав альтернативы

Альтернативный метод окрашивания все равно может содержать метиленовый синий. Один из примеров — Giemsa: Merck описывает свой продукт как раствор Azure B-эозина-метиленового синего, предназначенный, среди прочего, для мазков крови и костного мозга. Это может быть другой метод для другого образца, но он не соответствует требованию исключить метиленовый синий.

Если исключение определенного соединения является частью эксперимента, перед сравнением изображений проверяйте идентичность реагента и его состав. В руководстве по метиловому синему, метиленовому синему и красителям с похожими названиями рассматриваются различия в наименованиях.

Проверьте замену перед использованием результата

Для нового метода проведите небольшое сравнительное исследование на репрезентативных образцах с подходящим контролем. По возможности сохраняйте сопоставимые настройки микроскопа. Записывайте состав реагента, способ подготовки образца, условия воздействия и параметры визуализации, чтобы причины получения более качественного изображения можно было исследовать, а не просто предпочесть его визуально.

Оценивайте успешность относительно исходного вопроса. Для морфологии определите, остаются ли границы клеток и их расположение пригодными для интерпретации. Для ядерного мечения оценивайте локализацию сигнала и фон. Для оценки жизнеспособности требуйте данных помимо привлекательного цветового разделения. В более общем руководстве по окрашиванию метиленовым синим и его лабораторным применениям объясняется, как наблюдение связано с подготовкой препарата.

Выбирайте альтернативу, которая сохраняет необходимое вам измерение. Цвет — лишь одно из свойств получаемого изображения.