Măsurarea efectelor mitocondriale ale albastrului de metilen: oxigen, ATP și potențial de membrană

Să presupunem că un laborator adaugă albastru de metilen la mitocondrii cu respirația afectată și observă o creștere a consumului de oxigen. Afirmația firească ar fi că acest colorant a restabilit funcția mitocondrială. Afirmația poate fi greșită. Fluxul de oxigen, sinteza ATP și potențialul de membrană sunt trei concepte distincte. Au în comun același organit, așa cum copierea de siguranță, sincronizarea și partajarea au în comun același folder din cloud: sunt legate, dar se supun unor reguli diferite. Dacă le confundați, interpretarea devine greșită, chiar dacă fiecare măsurătoare este corectă din punct de vedere tehnic.

Albastrul de metilen favorizează această confuzie deoarece participă la sistemul pe care îl măsoară. Este un compus care parcurge cicluri redox, acceptând electroni în amonte și cedându-i în aval, un cation lipofil care se acumulează în mitocondriile energizate și un compus intens albastru care absoarbe și emite lumină în aceleași benzi ca sondele uzuale. O singură măsurătoare nu poate acoperi toate acestea. Abordarea fiabilă, demonstrată în studiile mitocondriale din Budapesta, constă în măsurarea fluxului de oxigen, a vitezei de sinteză a ATP, a potențialului de membrană și a eliberării de peroxid de hidrogen, cu controale specifice colorantului la fiecare etapă.

Respirometria măsoară fluxul de oxigen, nu producția de energie

Respirometria de înaltă rezoluție, fie prin Oroboros Oxygraph, fie prin analizorul de flux extracelular Seahorse, indică un singur lucru: cât de repede este redus oxigenul. Nu indică numărul de protoni pompați pentru fiecare electron, cât din gradient a fost păstrat sau dacă ATP-sintaza l-a utilizat.

Terminologia contează. În mitocondriile izolate, substratul fără ADP produce respirație asociată scurgerii de protoni, substratul cu ADP în concentrație saturantă indică capacitatea de fosforilare oxidativă, iar titrarea cu un decuplor indică capacitatea maximă de transfer al electronilor. În celulele intacte, echivalentele Seahorse sunt respirația bazală, respirația legată de ATP și sensibilă la oligomicină, scurgerea de protoni, respirația maximă definită prin FCCP și consumul de oxigen nemitocondrial rezistent la rotenonă plus antimicină. Denumirea rezultatelor Seahorse drept Starea 3 și Starea 4 le atribuie o precizie pe care preparatul nu o permite, după cum arată cadrul Agilent Mito Stress Test.

Albastrul de metilen rupe legătura intuitivă dintre mai mult oxigen și mai multă energie. În mitocondriile izolate din creierul de cobai, colorantul în concentrații de la 100 nM la 1 uM a crescut consumul de oxigen în repaus cu substraturi de glutamat plus malat, succinat și alfa-glicerofosfat, cu o creștere de aproximativ 64 la sută pentru alfa-glicerofosfat, însă respirația stimulată de ADP în mitocondriile sănătoase a rămas practic neschimbată, conform studiului asupra mitocondriilor cerebrale izolate. Deoarece respirația asociată scurgerii de protoni a crescut, în timp ce fluxul stimulat de ADP a rămas constant, raportul de control respirator calculat scade. Această scădere nu înseamnă că colorantul a deteriorat mitocondriile. Înseamnă că a adăugat un ciclu redox consumator de oxigen peste respirația normală. Un test de consum de oxigen cu albastru de metilen care raportează doar creșterea a măsurat un proces chimic real, fără să spună nimic despre conservarea energiei.

Experimentele de restabilire arată aceeași discrepanță la o scară mai mare. Cu Complexul I blocat, fluxul de oxigen a crescut de aproximativ trei ori, în timp ce sinteza ATP a crescut doar de aproximativ 1.5 ori. Mai mult oxigen a ajuns la electrod. O proporție mai mică din acesta a susținut producția de ATP. Orice afirmație despre îmbunătățirea fosforilării oxidative trebuie susținută și de datele privind ATP, ideal exprimate ca raport ATP per oxigen, cu precizarea convenției folosite pentru numitor.

Testele ATP măsoară viteza de sinteză, pe care conținutul nu o poate înlocui

Un test ATP răspunde la o altă întrebare: cât ATP este generat pe unitatea de timp. O măsurătoare cinetică, fie prin luminescența luciferazei de licurici urmărită timp de câteva minute, fie printr-un test cuplat cu hexokinază și glucozo-6-fosfat dehidrogenază, citit la 340 nm, furnizează o viteză. O singură măsurătoare finală a ATP total furnizează un conținut, care reflectă sinteza minus consumul și care, de unul singur, spune puține despre fosforilarea oxidativă.

Grupul din Budapesta a utilizat metoda enzimatică cuplată, cu adenilat-kinaza inhibată, și a constatat că albastrul de metilen la 1 până la 2 uM a crescut modest, dar semnificativ, producția de ATP în mitocondriile tratate cu rotenonă și în cele tratate cu antimicină. Aceasta este o restabilire reală și parțială. Studiul privind toxicitatea TEGDMA a obținut un rezultat similar într-un model diferit: monomerul dentar TEGDMA la 5 mM a redus drastic respirația legată de Complexul I, de la aproximativ 286 la 28 de unități de flux, iar colorantul la 2 uM a restabilit-o la aproximativ 86.

Două controale sunt indispensabile în cazul unui compus colorat cu activitate redox. Mai întâi, utilizați oligomicină pentru a stabili cât din sinteza ATP măsurată depinde de ATP-sintază. În al doilea rând, efectuați un test de recuperare a adaosului într-un sistem fără celule, folosind o cantitate cunoscută de ATP, reactivul complet și exact concentrațiile de colorant utilizate, cel puțin 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM și 2 uM. Colorantul poate absorbi lumina emisă, poate inhiba enzima raportoare sau poate modifica chimia redox a reactivului, iar recomandările generale pentru testele cu luciferază recomandă teste biochimice de contraverificare tocmai pentru această clasă de interferențe. Nu presupuneți că 1 uM nu produce artefacte doar pentru că stingerea fluorescenței este de obicei mai accentuată la concentrații mai mari.

Sondele pentru potențialul de membrană măsoară distribuția colorantului, nu fluxul

Safranina O, TMRM și TMRE, rodamina 123 și JC-1 sunt toate cationi permeabili prin membrană. Se acumulează în matricea încărcată negativ în funcție de echilibrul electrochimic, astfel încât fluorescența globală indică indirect potențialul, prin localizarea sondei. Niciuna dintre ele nu măsoară ATP sau fluxul de electroni.

Fiecare sondă are un tip de preparat pentru care este mai potrivită. Safranina O este adecvată pentru mitocondrii izolate și celule permeabilizate, de obicei la aproximativ 2 uM, cu excitație în jur de 495 nm și emisie în jur de 585 nm, funcționând într-un regim de stingere a fluorescenței în care captarea modifică fluorescența globală. TMRM și TMRE sunt potrivite pentru celule intacte, la încărcare nanomolară scăzută, într-un mod fără stingerea fluorescenței, în care depolarizarea eliberează colorantul și fluorescența mitocondrială scade; la încărcare mare, sensul semnalului se poate inversa prin autostingere. JC-1 oferă un raport verde-roșu convenabil, dar depinde de încărcare și de masa mitocondrială, ceea ce îl face mai puțin potrivit pentru analize cantitative decât TMRM în condiții atent controlate. Aceste compromisuri sunt rezumate într-o sinteză larg utilizată despre sondele pentru potențialul membranei mitocondriale.

Albastrul de metilen produce interferențe optice chiar la concentrațiile de lucru. Benzile sale de absorbție, situate între aproximativ 600 și 665 nm, se suprapun cu emisia roșie a sondelor, astfel încât efectele de filtru intern, stingerea fluorescenței și absorbția luminii de excitație sunt toate plauzibile. Colorantul este și un al doilea cation lipofil, a cărui distribuție se modifică odată cu potențialul măsurat. Protecția constă în redundanță și probe martor: sonda singură, colorantul singur, sonda plus fiecare concentrație de colorant, depolarizare completă cu FCCP ca referință zero și, ideal, o a doua sondă distinctă optic. Studiul privind ocolirea Complexului III a stabilit acest precedent, repetând măsurarea restabilirii potențialului de membrană atât cu safranină O, cât și cu TMRM, după inhibarea cu antimicină și mixotiazol, și obținând aceeași restabilire calitativă. Un singur indicator optic este un indiciu. Doi indicatori independenți constituie dovezi.

Trei preparate, trei întrebări diferite

Mitocondriile izolate, celulele permeabilizate și celulele intacte nu sunt setări de sensibilitate interschimbabile ale aceluiași test. Sunt concepte diferite, cu principii de funcționare diferite.

Mitocondriile izolate păstrează lanțul de transport al electronilor, membrana internă și aparatul molecular al matricei, în timp ce membrana plasmatică, citosolul și arhitectura rețelei sunt îndepărtate. Tocmai aceasta este ideea: substraturile, ADP, inhibitorii și concentrațiile de colorant sunt definite exact, astfel încât se poate identifica o cale. Prețul este pierderea aportului nativ de substrat, a semnalizării și a necesarului energetic.

Celulele permeabilizate păstrează mitocondriile în mare parte din arhitectura lor celulară, permițând în același timp trecerea substraturilor exogene și a ADP prin membrana plasmatică deschisă. Sunt instrumentul potrivit pentru identificarea unui defect al unei căi de utilizare a substratului într-un context celular. Permeabilizarea excesivă deteriorează membrana externă, iar reglarea citosolică se pierde prin spălare.

Celulele intacte păstrează totul: bariera membranei plasmatice, reducătorii citosolici, transportul substraturilor endogene, rețeaua mitocondrială și necesarul de ATP. Sunt cele mai apropiate de fiziologie și cele mai îndepărtate de elucidarea mecanismului, deoarece captarea, reducerea și sechestrarea colorantului modelează toate expunerea mitocondrială efectivă.

Studiul TEGDMA a utilizat deliberat toate cele trei niveluri: mitocondrii cerebrale izolate pentru restabilirea oxidării și a potențialului prin colorant, celule stem din pulpa dentară permeabilizate în principal pentru a localiza leziunea la oxidarea substraturilor legată de Complexul I și celule stem intacte pentru efectul fiziologic net al colorantului la 2 uM asupra consumului de oxigen diminuat. Pentru cititorii care compară măsurătorile mitocondriale între preparate, articolul explicativ complementar despre modul în care albastrul de metilen transferă electronii prin lanțul respirator oferă contextul căilor implicate, iar ghidul de interpretare a studiilor despre respirație cu albastru de metilen explică logica concentrațiilor și a inhibitorilor.

Controalele necesare pentru un colorant activ redox

Un compus care parcurge cicluri redox necesită o listă de controale mai lungă decât un inhibitor obișnuit, deoarece reacțiile chimice ale colorantului singur pot imita procese biologice.

Pentru respirometrie, utilizați o cameră doar cu tampon pentru evaluarea derivei, o cameră cu tampon plus colorant fără material biologic, colorant plus orice reducător extracelular prezent în test și, la final, rotenonă plus antimicină pentru a defini consumul de oxigen nemitocondrial în celulele intacte. Rețineți că forma redusă a colorantului se reoxidează transferând electroni către oxigen pentru a forma peroxid de hidrogen, astfel încât o probă martor doar cu colorant, fără un donor de electroni, subestimează consumul de oxigen din sistemul fără celule care apare atunci când NADH sau NADPH este disponibil.

Pentru peroxidul de hidrogen, preferați un sistem calibrat cu Amplex UltraRed plus peroxidază din hrean în locul coloranților neselectivi DCFDA, verificați cu catalază și testați dependența de iluminare, deoarece colorantul este un fotosensibilizator. Studiul asupra mitocondriilor cerebrale a constatat că nivelul peroxidului a crescut de peste patru ori la doar 100 nM de colorant, în timp ce eliminarea a încetinit, peroxidul fiind format direct de colorantul redus, fără un intermediar superoxid. Detaliile despre alegerea sondelor și controalele de iluminare se găsesc în articolul complementar despre măsurarea speciilor reactive de oxigen în experimentele cu coloranți, iar întrebarea mai largă privind situațiile în care peroxidul acționează ca semnal sau ca povară oxidativă este abordată alături de echilibrul redox celular și afirmațiile despre antioxidanți.

Pentru afirmațiile despre căile implicate, testați ambele situsuri de inhibare ale Complexului III: antimicină A la situsul Qi și mixotiazol la situsul Qo, plus un test final al Complexului IV cu cianură. Un studiu anterior asupra creierului de șoarece a raportat restabilirea prin colorant a respirației blocate de rotenonă, dar nu și a celei blocate de antimicină, în timp ce studiul ulterior pe trei specii a constatat o restabilire parțială cu ambii inhibitori și dovezi ale reducerii directe a citocromului c. Considerați ocolirea ca fiind compatibilă cu datele mai noi, nu ca fiind definitiv stabilită, deoarece concentrația colorantului, situsul de inhibare, starea substratului și distribuția colorantului modifică toate traseul observat.

Matrice de selecție a testelor

Utilizați acest tabel pentru a alege măsurătoarea pornind de la întrebare, nu invers.

Pentru ca o afirmație să fie minim convingătoare, trebuie testate aceleași concentrații de colorant, 100 nM, 300 nM, 1 uM și 2 uM, pentru fluxul de oxigen în condiții de scurgere de protoni, ADP, oligomicină și decuplor, viteza de sinteză a ATP, potențialul de membrană, de preferință cu două sonde, și eliberarea de peroxid calibrată, cu catalază și controale fără celule. Raportați setul corelat: flux de oxigen plus viteza de sinteză a ATP plus ATP per oxigen plus potențial plus peroxid. Oricare dintre aceste valori, luată singură, este o măsurătoare în căutarea unui sens.