Măsurarea speciilor reactive de oxigen în experimentele cu albastru de metilen

Două laboratoare desfășoară ceea ce fiecare numește un experiment privind efectul antioxidant al albastrului de metilen. Unul raportează că acest colorant reduce speciile reactive de oxigen. Celălalt raportează că le generează. Ambele prezintă curbe doză-răspuns clare. Ambele sunt sincere. Diferența nu ține de fraudă sau de incompetență. Cele două grupuri au măsurat lucruri diferite, în condiții de iluminare diferite, cu sonde care răspund la întrebări diferite, apoi au descris ambele răspunsuri folosind același termen: ROS.

Albastrul de metilen este o moleculă dificil de măsurat cu precizie, deoarece participă la procesele chimice pe care ar trebui să le observe. În întuneric, transportă electroni între donori și acceptori și revine la forma inițială, pregătit pentru un nou ciclu. Sub acțiunea luminii, devine un fotosensibilizator, ajungând într-o stare triplet excitată din care poate transfera energie oxigenului pentru a forma oxigen singlet sau poate transfera electroni pentru a forma radicali și peroxid de hidrogen. Orice sondă introdusă în acest sistem poate fi oxidată, redusă, decolorată sau mascată optic de colorantul însuși. Așadar, prima întrebare privind orice măsurare a ROS nu este niciodată care este valoarea obținută. Este ce detectează de fapt testul și ce efect are colorantul asupra testului.

Amplex Red: un test calibrat pentru peroxidul de hidrogen

Combinația albastru de metilen–Amplex Red este cea mai solid fundamentată asociere din această literatură, atunci când este configurată corect. Chimia este specifică: peroxidaza din hrean folosește peroxidul de hidrogen pentru a oxida substratul Amplex la un produs fluorescent, resorufina, într-un raport stoechiometric de aproximativ unu la unu. Peroxidul din probă se transformă în fluorescență la detector. Nicio altă specie din familia clasică a ROS nu determină direct această reacție.

Avantajul decisiv este calibrarea. Un cercetător atent analizează standarde cu cantități cunoscute de peroxid în același tampon, cu aceleași concentrații de peroxidază și substrat, același timp de incubare și aceleași setări optice, apoi interpretează probele în raport cu acea curbă. În studiul pe mitocondrii cerebrale izolate care stă la baza acestei metode, autorii au făcut exact acest lucru, adăugând cantități cunoscute de peroxid la sfârșitul fiecărei determinări, iar valorile sunt raportate ca rate în picomoli pe minut pe miligram de proteină, nu în unități arbitrare de fluorescență. Asta transformă o emisie luminoasă într-o măsurare.

Trei detalii din acel studiu merită urmate. În primul rând, autorii au verificat semnalul cu catalază, care descompune peroxidul. Creșterea fluorescenței indusă de albastrul de metilen s-a oprit la adăugarea catalazei, confirmând că semnalul provenea de la peroxid, nu de la un artefact optic. În al doilea rând, au testat direct iluminarea, folosind un obturator pentru fasciculul de excitație, astfel încât probele să primească o optime din doza obișnuită de lumină, iar semnalul a scăzut cu doar nouă procente. Mai mult de nouăzeci la sută din peroxidul raportat era independent de lumina folosită pentru măsurare. În al treilea rând, au măsurat separat eliminarea peroxidului cu un electrod și au constatat că acest colorant atât creștea producția, cât și încetinea eliminarea. O sondă care raportează doar fluorescența netă ar fi confundat aceste două efecte.

Testul are totuși limite, iar albastrul de metilen scoate la iveală mai multe dintre ele. Colorantul absoarbe într-un interval larg din aceeași regiune roșie în care emite resorufina, astfel încât, la concentrații mari de colorant, proba își poate masca propriul semnal prin efecte de filtru intern. Prin urmare, standardele trebuie să conțină aceeași concentrație de colorant ca probele. Amplex Red se poate și fotooxida de la sine, iar produsul său, resorufina, poate intra în cicluri fotoredox care generează superoxid și peroxid, ceea ce contează foarte mult când experimentul iluminează și un fotosensibilizator. Soluția practică este iradierea mai întâi a probelor cu albastru de metilen și apoi analizarea alicotelor cu reactivi Amplex în întuneric, în locul iluminării simultane a colorantului și a sondei. În cele din urmă, superoxid dismutaza nu reduce pur și simplu un semnal Amplex: conversia superoxidului în peroxid îl poate crește. Un control cu SOD care crește fluorescența nu a eșuat. El a identificat superoxidul ca specie situată în amonte.

DCFDA: un indicator nespecific al oxidării

Asocierea albastru de metilen–DCFDA este sursa celei mai mari părți a confuziei. DCFH-DA este un precursor folosit pentru încărcarea celulelor cu sondă. Esterazele din interiorul celulei îi îndepărtează grupările acetat, lăsând DCFH nefluorescent, iar oxidarea DCFH produce DCF fluorescent. Lista speciilor care îl oxidează este lungă: radicali hidroxil, intermediari ai peroxidazei și ai hemului, dioxid de azot, acid hipocloros și radicali derivați din peroxinitrit. Peroxidul de hidrogen singur nu îl oxidează direct cu o viteză utilă; fluorescența dependentă de peroxid necesită, în general, participarea fierului, a proteinelor hemice sau a unor reacții cu peroxidază.

Analiza critică pe care ar trebui să o citeze orice secțiune de metode provine din evaluarea DCFH ca sondă realizată de Kalyanaraman și colegii săi, rezumată în studiul pe mitocondrii cerebrale care a respins DCFDA din acest motiv. Aceștia au arătat că sonda reacționează lent, cu o stoechiometrie necaracterizată, fără o calibrare validă și inclusiv cu compuși care nu sunt ROS. Sonda amplifică și ceea ce măsoară: oxidarea DCFH prin transferul unui electron produce un radical DCF care reacționează cu oxigenul pentru a forma superoxid, iar acesta se dismutează, generând peroxid suplimentar. Măsurarea produce, parțial, chiar reacțiile chimice pe care le raportează.

Nimic din toate acestea nu face DCFDA inutilă. O face un instrument de screening, nu de identificare. O creștere a fluorescenței DCF înseamnă că oxidarea sondei dependentă de oxidanți a crescut. Nu înseamnă că peroxidul a crescut și cu siguranță nu înseamnă că totalul ROS a crescut, o mărime pe care nicio sondă individuală nu o măsoară. Cercetările mai vechi asupra albastrului de metilen care s-au bazat pe oxidarea DCF la concentrații de peste un micromolar au raportat efecte prooxidante, în timp ce alte sisteme din aceeași perioadă au indicat protecție împotriva morții celulare induse de peroxid. Ambele observații pot fi adevărate pentru același colorant în contexte redox diferite, iar rezultatul DCF, singur, nu poate spune care oxidant a generat semnalul. Importanța cercetării anterioare pe mitocondrii cerebrale constă în faptul că a înlocuit acest screening cu o măsurare calibrată a peroxidului și a evidențiat direct nivelul produs: chiar și o concentrație de o sută de nanomolari de colorant a crescut de câteva ori eliberarea de peroxid pentru fiecare substrat și stare respiratorie testate.

DCFDA mai prezintă o capcană specifică albastrului de metilen. Colorantul este intens colorat și activ redox, astfel încât poate diminua fluorescența prin fotodecolorare, poate stinge emisia sau poate oxida sonda independent de ROS celulare. Un control acelular cu colorant și sondă, dar fără celule, nu este un accesoriu opțional. Este experimentul care arată dacă acest colorant interacționează cu sonda.

Captarea de spin și consumul de oxigen: identitate și flux

În timp ce sondele fluorescente indică apariția unei specii capabile să le oxideze, rezonanța de spin electronic cu agenți de captare a spinului oferă informații mai apropiate de identitatea acelei specii. Studiul clasic al fotochimiei albastrului de metilen a folosit ESR pentru a detecta radicalul ascorbat în prezența colorantului, a ascorbatului și a luminii, apoi a demonstrat formarea peroxidului în experimente de consum de oxigen și formarea radicalilor hidroxil catalizată de fier în experimente de captare de spin. Fiecare tehnică a răspuns la întrebarea la care celelalte nu puteau răspunde: ESR a identificat radicalii, consumul de oxigen a indicat fluxul reacției independent de orice sondă fluorescentă, iar combinația a arătat că în același sistem iluminat funcționau atât căi care implicau oxigen singlet, cât și căi radicalice.

Acel rezultat din 1984 poate fi citit și astăzi ca un avertisment. În prezența iluminării și a unui agent reducător, colorantul genera peroxid, iar în prezența fierului, sistemul producea radicalul hidroxil, cea mai reactivă specie din grup. Autorii au asociat acest lucru cu ascorbatul din ochi și au pus sub semnul întrebării utilizarea oftalmică fără precauții. Cititorii de astăzi ar trebui să observe condițiile: lumină plus agent reducător plus fier. Dacă oricare dintre acestea lipsește, calea se atenuează sau dispare.

Electrozii de oxigen își justifică utilitatea în alt mod. Un electrod de tip Clark măsoară consumul net de oxigen, ceea ce confirmă că reacțiile redox determinate de colorant consumă oxigen molecular și furnizează date cinetice pe care niciun artefact de fluorescență nu le poate imita. Nu identifică produsul. Formarea peroxidului, a superoxidului și a apei, precum și dezactivarea oxigenului singlet implică toate consum de oxigen. Fluxul fără identitate este la fel de incomplet ca identitatea fără flux, motiv pentru care lucrările solide asociază electrodul cu un test calibrat pentru peroxid sau cu un agent de captare.

De ce rezultatele privind efectele antioxidante sunt contradictorii

Puse una lângă alta, cele trei tipuri de măsurare explică aparenta contradicție din literatura despre albastrul de metilen prin diferențe de metodă și trei realități biologice.

În primul rând, colorantul este atât un transportor de electroni, cât și o sursă de peroxid. Prin devierea electronilor de la situsurile respiratorii în care oxigenul ar deveni altfel superoxid, poate reduce o specie ROS, în timp ce forma sa redusă reduce oxigenul direct la peroxid, crescând o altă specie. Prin urmare, un laborator care studiază chimia redox mitocondrială și rolul său de cale alternativă ar trebui să se aștepte la răspunsuri dependente de sondă: un semnal sensibil la superoxid scade, în timp ce un semnal pentru peroxid crește în aceeași cuvetă.

În al doilea rând, peroxidul în doze mici este un semnal, nu doar o sursă de deteriorare. Studiul pe mitocondrii cerebrale de șoarece care a urmat cercetării anterioare a constatat generarea de peroxid de la concentrații de colorant de numai cincizeci de nanomolari, fără leziuni ale ADN-ului mitocondrial la niveluri terapeutice, precum și protecție împotriva leziunilor induse de rotenonă după pretratament. Numai la o sută de micromolari, mult peste intervalul terapeutic, colorantul a deteriorat anumite fragmente de ADN, iar lumina roșie împreună cu o concentrație de douăzeci de micromolari de colorant a produs oxigen singlet care a deteriorat toate fragmentele testate. Mecanismul propus este hormetic: o producție moderată de peroxid declanșează mecanismele de apărare antioxidantă asociate cu Nrf2 și biogeneza mitocondrială, astfel încât un rezultat prooxidant pe termen scurt precedă un efect antioxidant pe termen mai lung. Un test citit după o oră și un test citit după o zi pot da rezultate diferite, deoarece procesele biologice s-au schimbat între cele două momente.

În al treilea rând, lumina determină chiar ce moleculă este prezentă. Iluminarea demetilează colorantul, ducând la formarea Azure B și a unor produși înrudiți, iar lampa microscopului deasupra unei plăci este suficientă pentru a-l fotosensibiliza. Experimentele în întuneric și cele cu iluminare sunt experimente diferite, iar secțiunea privind controalele de iluminare și manipularea colorantului din orice protocol ar trebui să le trateze ca atare.

Un set minim de controale și cum trebuie interpretată orice afirmație

Comparația de mai jos este materialul de referință original al acestui articol. Înainte de a accepta orice rezultat privind ROS obținut cu albastru de metilen, verificați ce rânduri au acoperit autorii și pe care le-au omis.

De aici rezultă o regulă practică de interpretare. Amplex cu peroxidază, calibrat și verificat cu catalază, oferă dovezi despre peroxid. DCFDA oferă dovezi despre oxidarea nespecifică a sondei și nimic mai mult. Captarea de spin cu controale care folosesc agenți de neutralizare oferă dovezi despre identitatea radicalilor. Consumul de oxigen oferă dovezi despre flux. O propoziție care afirmă mai mult decât poate susține testul folosit, oricât de sigur ar fi formulată, este o propoziție despre sondă, nu despre colorant. Discuțiile conexe despre dependența de doză și intervalul hormetic, fluxul mitocondrial de electroni, interferențele în teste cu probe colorate și artefactele de iluminare în microscopie dezvoltă fiecare dintre aceste aspecte, iar fiecare rămâne valabil odată ce referința sa provizorie este înlocuită.