Colorarea celulelor bucale cu albastru de metilen: ce să observi

O elevă pune pe o lamă o picătură de suspensie de celule bucale, privește prin microscop și nu vede aproape nimic. Câteva siluete palide plutesc printr-un câmp luminos. Ajustează focalizarea, apoi mărește iluminarea și ajunge la concluzia că lama este goală. Lama nu este goală. Celulele sunt acolo. Sunt aproape transparente, iar transparența este tocmai problema pe care această colorare o rezolvă.

Merită să explicăm această nepotrivire dintre așteptări și imagine înainte de a începe protocolul. Începătorii se așteaptă ca microscopul să dezvăluie detalii așa cum zoomul unei camere face lizibil un indicator aflat la distanță. Un microscop în câmp luminos face ceva mai restrâns: arată diferențe de absorbție a luminii. O celulă bucală necolorată nu absoarbe aproape deloc lumina, deci aproape că nu produce nicio diferență. Albastrul de metilen adaugă această diferență. Se leagă neuniform în interiorul celulei și transformă structura în contrast. Odată ce elevii înțeleg acest concept, fiecare pas ulterior devine o consecință logică, nu o rețetă.

Aici sunt utile câteva noțiuni despre modul în care colorările simple adaugă contrast în laboratorul școlar, iar o recapitulare despre pregătirea unui microscop în câmp luminos înainte de colorare previne jumătate dintre preparatele nereușite. Chimia din spatele culorii este explicată în introducerea în utilizarea albastrului de metilen în microscopie, care arată de ce acest colorant apare atât de des pe masa de laborator.

Protocolul pentru laboratorul școlar

Varianta de preparat umed de mai jos este opțiunea implicită mai simplă pentru orele obișnuite. Nu necesită flacără și nici o etapă de fixare. Varianta cu frotiu fixat, folosită în unele manuale universitare, adaugă uscarea la aer și o scurtă fixare termică, așa cum se descrie în activitatea cu frotiu bucal a North Central Texas College, publicată prin Biology LibreTexts, dar fixarea termică este o practică de microbiologie, nu o cerință pentru observarea celulelor epiteliale.

Materiale necesare: lame și lamele curate, tampoane sterile de unică folosință (de preferat) sau scobitori plate noi, un flacon cu picurător cu soluție apoasă de albastru de metilen de 0.5 până la 1 procent, apă distilată sau deionizată, hârtie absorbantă, mănuși și un microscop optic compus cu mărire totală de 100x și 400x.

1. Clătiți gura cu apă simplă. Astfel se îndepărtează particulele alimentare care ulterior se colorează intens și distrag atenția de la celule.
2. Fiecare elev prelevează o probă doar din propriul obraz. Frecați ușor interiorul obrazului cu un tampon steril nou. Apăsați, nu răzuiți. Opriți-vă cu mult înainte să apară orice disconfort sau sângerare.
3. Rulați tamponul prin centrul unei lame curate, lăsând un strat subțire. O peliculă subțire este cel mai important factor pentru obținerea unui preparat ușor de interpretat. Un depozit alb gros se va colora într-o masă albastră imposibil de interpretat.
4. Adăugați o picătură de albastru de metilen peste frotiu. Lăsați să acționeze între 1 și 3 minute. Un minut este suficient în multe protocoale universitare; manualul de laborator de științe NCERT pentru clasa a IX-a folosește aproximativ 3 minute pentru un preparat temporar. Mai mult timp nu înseamnă un rezultat mai bun, iar supracolorarea este cea mai frecventă greșeală legată de durată.
5. Clătiți ușor cu apă distilată sau îndepărtați excesul de colorant prin absorbție cu hârtie absorbantă, respectând protocolul local. Fundalul ar trebui să devină albastru pal, nu bleumarin intens.
6. Coborâți lamela înclinată, astfel încât o margine să atingă prima preparatul, apoi lăsați-o să coboare lent. Astfel evitați formarea bulelor de aer.
7. Începeți cu o mărire mică pentru a găsi celulele, verificați focalizarea și centrarea, apoi treceți la 100x și, în final, la 400x. La 400x folosiți doar reglajul fin al focalizării.

Concentrația colorantului merită o precizare. Protocoalele școlare folosesc de obicei soluție apoasă de albastru de metilen de aproximativ 1 procent. O soluție stoc mai concentrată sau o expunere prelungită intensifică mai repede culoarea fundalului decât pe cea a nucleului, inversând contrastul pe care se bazează exercițiul.

Manipularea în siguranță a materialului bucal

Probele bucale conțin salivă și microorganisme orale normale, așa că tratați fiecare frotiu proaspăt ca pe un material potențial infecțios, chiar dacă donatorii sunt colegi sănătoși. Ghidul de biosiguranță al American Society for Microbiology pentru laboratoarele didactice stabilește principiile generale: evaluați riscurile înainte de activitate, purtați mănuși, protejați ochii dacă există posibilitatea stropirii, spălați mâinile după activitate, dezinfectați mesele de laborator și eliminați consumabilele contaminate prin circuitul aprobat pentru deșeurile biologice.

Patru reguli pentru clasă acoperă cea mai mare parte a riscurilor. Un singur donator pentru fiecare tampon și fiecare lamă; acestea nu se folosesc niciodată în comun. Doar autoprelevare, niciodată prelevare de la un coleg. Tampoanele și scobitorile de unică folosință se aruncă direct în recipientul de deșeuri desemnat, nu se pun niciodată înapoi pe masa de laborator. Albastrul de metilen pătează pielea și hainele și irită ochii, așa că sunt necesare mănușile și regulile obișnuite de igienă pentru lucrul cu coloranți. Nu extindeți acest exercițiu prin cultivarea niciunui material din frotiu și nu improvizați fixarea termică a materialului uman proaspăt în afara procedurii de siguranță a școlii.

Ce să observați și de ce arată astfel

La 100x, căutați celule late, plate, de un albastru pal, cu contururi ovale neregulate sau poligonale. Apar izolat sau în grupuri slab suprapuse. Fiecare celulă are de obicei o pată de un albastru mai închis. Acea pată este nucleul. Observați și dispunerea: celulele epiteliale pavimentoase sunt ca niște plăcuțe subțiri, nu ca niște sfere, motiv pentru care marginile lor seamănă cu o glazură crăpată, nu cu niște baloane rotunde.

La 400x se disting clar trei elemente. Limita celulei apare ca o linie subțire, mai închisă la culoare, care o înconjoară. Citoplasma umple interiorul cu un albastru deschis uniform. Nucleul este mai închis și mai compact, adesea oval, de obicei aproape de centru, dar nu întotdeauna. Cereți elevilor să consemneze toate cele trei elemente, precum și forma și mărirea, deoarece fișa de lucru solicită exact aceste informații.

Aici contează o precizare de acuratețe pe care multe fișe de lucru o prezintă greșit. Limita vizibilă corespunde regiunii membranei plasmatice, dar membrana în sine, un bistrat lipidic de aproximativ 7 până la 10 nanometri grosime, este mult sub limita de rezoluție a unui microscop școlar. Elevii văd marginea optică a celulei împreună cu colorantul acumulat acolo. Aceeași precauție se aplică organitelor. Mitocondriile, reticulul endoplasmatic, aparatul Golgi și ribozomii nu sunt vizibili în acest preparat. Un microscop optic convențional poate distinge detalii de până la aproximativ 0.2 micrometri în condiții bune, după cum explică prezentarea NCBI de biologie celulară despre instrumentele de microscopie, iar majoritatea elementelor ultrastructurale se află sub această limită sau aproape de ea. O mărire suplimentară fără câștig de rezoluție face imaginea mai mare, fără a adăuga detalii.

De ce se colorează nucleul cel mai intens? Albastrul de metilen este un colorant cationic, încărcat pozitiv în soluție, și se asociază cu materialul încărcat negativ din celulă, în primul rând cu acizii nucleici. Cromatina concentrează ADN-ul în nucleu, astfel încât nucleul acumulează cea mai mare cantitate de colorant. Citoplasma conține ARN și alte molecule încărcate electric, așa că se colorează și ea, dar mai difuz și mai slab. Precizarea esențială: albastrul de metilen nu este un colorant specific pentru ADN. Cercetările privind distribuția albastrului de metilen în imagistica nucleului descriu asocierea cationului cu regiunile bogate în acizi nucleici, iar cercetări cantitative mai vechi privind legarea albastrului de metilen în preparate celulare au constatat că cea mai mare parte a colorantului legat era asociată cu acizii nucleici. Prin urmare, un nucleu închis la culoare și o citoplasmă deschisă reprezintă un tipar de contrast, nu o analiză moleculară.

Greșelile pe care le vor face elevii și cum să le interpretați

Aproape fiecare preparat nereușit se încadrează într-unul dintre cinci tipare. Învățați elevii să identifice problema preparatului în loc să îl refacă orbește.

Supracolorarea face celulele și fundalul uniform închise la culoare, astfel încât nucleul se pierde în câmpul vizual. Corectați problema printr-un timp de colorare mai scurt sau o clătire mai temeinică. Colorarea insuficientă lasă siluete palide care dispar când crește iluminarea; prelungiți timpul în trepte de treizeci de secunde. Frotiurile groase produc mase dense, suprapuse, în care nu se poate urmări niciun contur; corecția este mecanică: întindeți un strat mai subțire data viitoare, deoarece nicio clătire nu poate salva o grămadă de celule. Bulele de aer apar ca niște cercuri perfecte, cu margini întunecate și bine definite, și îi distrag pe începătorii care le confundă cu structuri; repoziționați lamela lent, înclinată. Punctele mici și întunecate răspândite pe celule sau în jurul lor sunt de obicei bacterii orale normale, după cum menționează protocoale școlare precum procedura Ingrid Science pentru celule bucale. Ele confirmă că gura este populată de microorganisme, un lucru pe care elevii îl pot găsi memorabil, dar specia lor nu poate fi identificată în acest exercițiu și nu trebuie desenate ca părți ale celulei. Resturile alimentare și filamentele de mucus se colorează neuniform și intens; clătirea inițială are rolul de a le reduce.

Ce nu poate face acest exercițiu

Aceasta este o observație didactică, nu un test de diagnostic. Aspectul celulelor într-un preparat colorat la clasă nu poate diagnostica infecții, cancer sau vreo altă boală, iar articolul nu trebuie interpretat ca sugerând contrariul. Preparatul arată forma, limita celulei, citoplasma și nucleul la două măriri. Nu arată ultrastructura membranei, detaliile organitelor sau identitatea moleculară. Precizarea explicită a limitei protejează atât rigoarea științifică, cât și elevii: un rezultat bun este un desen etichetat corect, cu mărirea și colorantul consemnate, nu o concluzie despre sănătate.

Fișă de lucru pentru elevi și micrografii adnotate

Cele două materiale ale proiectului pentru această pagină sunt micrografia adnotată de mai sus și fișa de lucru de mai jos. Tipăriți câte o fișă pentru fiecare elev sau proiectați-o și cereți elevilor să copieze casetele în caiete.

Cum să o folosiți într-o sesiune de 45 de minute: zece minute pentru instructajul de siguranță și prelevare, zece minute pentru colorare și montare, cincisprezece minute pentru observație și schițare la ambele măriri, zece minute pentru lista de verificare și compararea cu micrografia adnotată. Elementele listei de verificare sunt intenționat simple și procedurale. Frotiu subțire, timp de colorare corect, nucleu mai închis la culoare decât citoplasma, mărire consemnată. Un elev care le poate bifa pe toate patru a înțeles conceptul pe care lecția urmărește să îl transmită: microscoapele arată diferențe, iar colorările creează diferențele care merită observate.