Albastrul de metilen nou și colorarea reticulocitelor: un colorant distinct și o metodă pentru celule vii

Un student se pregătește să numere reticulocitele, comandă albastru de metilen, îl amestecă cu sânge și nu vede aproape nimic. Un coleg folosește un flacon etichetat albastru de metilen nou și obține filamente albastre bine conturate în interiorul unei părți dintre eritrocite. Primul student presupune că al doilea flacon este mai proaspăt sau mai concentrat. Nu este nici una, nici alta. Conține o moleculă diferită.

Aceasta este eroarea conceptuală care stă la baza celor mai multe confuzii din acest domeniu. Denumirea sugerează că albastrul de metilen nou este un lot îmbunătățit de albastru de metilen. Chimia arată contrariul. Albastrul de metilen nou N este un colorant fenotiazinic distinct, cu propriul număr Colour Index, propriul model de substituție și propriul rol standardizat în hematologie. Odată ce această distincție este clară, restul metodei (de ce celulele trebuie să fie vii când sunt colorate, ce se consideră reticulocit, unde se încadrează corpii Heinz și când intervine albastrul briliant de cresil) devine ușor de înțeles.

Răspunsul pe scurt

Albastrul de metilen nou N, reactivul utilizat în hematologie, este identificat în general drept Basic Blue 24 în fișa PubChem pentru albastrul de metilen nou, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, cu formula C18H22ClN3S. Albastrul de metilen obișnuit este clorură de metiltioniniu, Basic Blue 9, în fișa sa PubChem, C.I. 52015, CAS 61-73-4, cu formula C16H18ClN3S. Din punct de vedere structural, albastrul de metilen nou are două grupări metil pe nucleu și lanțuri laterale etilamino în locul grupărilor dimetilamino din albastrul de metilen. Această diferență modifică comportamentul la colorare. Lucrările de hematologie descriu albastrul de metilen obișnuit drept un colorant relativ slab pentru reticulocite, iar albastrul de metilen nou ca producând o colorare mai intensă și mai uniformă, comparație rezumată în pagina tematică ScienceDirect despre albastrul de metilen nou.

Da, albastrul de metilen nou este un colorant supravital. Colorarea supravitală înseamnă colorarea celulelor vii după prelevarea din organism și înainte de fixare, conform definiției din prezentarea NCBI a principiilor colorării supravitale. Atât albastrul de metilen nou, cât și albastrul briliant de cresil aparțin acestei categorii, iar standardul CLSI pentru reticulocite include explicit albastrul de metilen nou ca colorant supravital. Studenții îl asociază uneori cu colorarea Romanowsky a frotiurilor fixate. Această abordare nu funcționează aici. Dacă fixați mai întâi, metoda nu mai funcționează.

Pentru cititorii care urmăresc denumirile unor coloranți asemănători, albastru de metil versus albastru de metilen tratează o confuzie diferită și mai amplă, între un colorant triarilmetanic anionic și familia fenotiazinică cationică. Prezentarea generală a colorării în laborator situează tehnicile supravitale alături de metodele pentru frotiuri fixate, iar ghidul de morfologie a celulelor sanguine arată unde se încadrează evaluarea reticulocitelor în tabloul mai larg al formulei leucocitare.

O precizare privind cataloagele: există o formă distinctă de albastru de metilen nou, ca sare dublă cu clorură de zinc, înregistrată sub CAS 6586-05-6. Prin urmare, secțiunea de metode ar trebui să precizeze forma sării și furnizorul, nu doar denumirea uzuală.

Ce face de fapt colorarea supravitală

Un reticulocit este un eritrocit tânăr care și-a pierdut nucleul, dar păstrează ARN ribozomal rezidual. Într-un preparat umed necolorat, acest ARN este invizibil. Colorantul supravital pătrunde în celula vie și precipită sau agregă acest ARN în granule și filamente albastre, materialul reticulofilamentos observat cu imersie în ulei. Rețeaua este, așadar, un produs al colorării, nu un schelet preformat care așteaptă să fie colorat. De aceea, variabilele protocolului (concentrația colorantului, tamponul, raportul sânge-colorant, temperatura, timpul) contează la fel de mult ca denumirea colorantului.

Consecința practică este o ordine strictă a operațiilor: mai întâi amestecați sângele recoltat pe anticoagulant cu colorantul, incubați, apoi realizați frotiuri și examinați-le nefixate și fără contracolorare. Fixarea înainte de colorare sau o contracolorare care maschează filamentele slab vizibile distruge informația de care depinde numărarea.

Un protocol practic pentru reticulocite cu albastru de metilen nou

Nu există o singură formulare universală, așa că precizați-o pe cea utilizată. Trei variante documentate ilustrează diversitatea.

Procedura clasică de tip Brecher utilizează aproximativ 0.5 procente albastru de metilen nou cu oxalat de potasiu, amestecat în volume egale cu sânge recoltat pe EDTA și bine omogenizat, cu incubare timp de aproximativ 10 până la 15 minute la temperatura camerei. După o reomogenizare blândă, se pregătesc frotiuri subțiri prin metoda în pană, se usucă la aer și se examinează nefixate cu obiectivul de 100x cu imersie în ulei. Procedura NCBI pentru numărarea reticulocitelor descrie acest flux de lucru și cadrul de numărare utilizat.

Varianta Dacie și Lewis utilizează 1.0 procente albastru de metilen nou în soluție salină cu citrat, amestecat cu 2 până la 4 volume de sânge și menținut la 37 C timp de 15 până la 20 minute înainte de realizarea frotiurilor. O implementare recentă de armonizare a procedurii CLSI H44 a utilizat o soluție mai diluată, de 0.1 procente, în soluție salină tamponată cu fosfat la pH 7.4, cu incubare la 20 C timp de 10 minute și fără fixare, conform studiului de armonizare NMB din 2026.

Regulile de numărare sunt comune tuturor variantelor. Clasificați o celulă ca reticulocit atunci când conține cel puțin două granule distincte colorate în albastru sau segmente de filamente, excluzând astfel depozitele izolate de colorant. Numărați cel puțin 1,000 eritrocite în examinările de rutină și raportați reticulocitele ca procent. La procente mici, cerințele statistice impun numărarea mai multor celule. O analiză a metodologiei CLSI H44 menționează că, la aproximativ 1 procent reticulocite, sunt necesare circa 4,400 celule pentru a reduce variația numărării la 5 procente, în analiza CLSI H44 de la De Gruyter. Un disc ocular Miller face posibilă numărarea practică a unui număr mare de celule. Filtrați colorantul sau preparați-l proaspăt, deoarece precipitatul imită incluziunile granulare.

Corpii Heinz în același preparat

Același frotiu colorat supravital poate evidenția și corpii Heinz, care sunt agregate de hemoglobină oxidată și denaturată, nu ARN rezidual. În preparatele cu albastru de metilen nou, aceștia apar ca formațiuni rotunde, adesea unice și situate lângă membrană, colorate într-un albastru mai deschis decât materialul reticulofilamentos. Se păstrează slab după fixare și contracolorare, așa că examinați frotiul nefixat. Un protocol recent, care a utilizat 20 microlitri de sânge recoltat pe EDTA cu 20 microlitri de albastru de metilen nou de 1 procent și o incubare de 15 minute, a cuantificat celulele pozitive pentru corpi Heinz dintr-un total de 250 eritrocite, în studiul PMC care descrie această procedură.

Două distincții previn interpretările greșite. În primul rând, violetul de metil și violetul de cristal colorează corpii Heinz mai intens decât albastrul de metilen nou, după cum se menționează în pagina tematică ScienceDirect despre corpii Heinz. Albastrul de metilen nou este alegerea practică atunci când reticulocitele și corpii Heinz sunt evaluați împreună, nu cel mai puternic colorant dedicat corpilor Heinz. În al doilea rând, incluziunile HbH la purtătorii de alfa-talasemie produc numeroase puncte fine în întreaga celulă după colorarea supravitală, în timp ce corpii Heinz clasici sunt mai puțini, mai mari și adesea asociați membranei. Depozitele de colorant reprezintă al treilea element care poate fi confundat cu acestea: se află în afara planului focal al celulelor și variază între câmpuri.

Albastru briliant de cresil versus albastru de metilen nou

Ambii coloranți sunt utilizați pentru colorarea supravitală a reticulocitelor, dar standardizarea favorizează unul dintre ei. Metoda CLSI H44-A2 pentru reticulocite, elaborată împreună cu Consiliul Internațional pentru Standardizare în Hematologie și prezentată pe pagina standardului CLSI H44, desemnează colorarea sângelui recoltat pe EDTA cu albastru de metilen nou drept metodă comparativă manuală. Învățământul clasic de hematologie susține aceeași observație privind aspectul: albastrul de metilen nou produce o colorare mai intensă și mai uniformă a filamentelor, în timp ce albastrul briliant de cresil variază mai mult între loturi și probe.

Acest statut necesită o precizare. Ghidul ICSH pentru evaluarea analizoarelor acceptă microscopia manuală cu albastru de metilen nou ca abordare de referință pentru comparație, dar o consideră subiectivă și relativ imprecisă, preferând procedurile de referință prin citometrie în flux acolo unde sunt disponibile. O comparație din 2022 pe 100 probe a constatat o abatere sistematică mai mică față de analizorul utilizat în cazul albastrului briliant de cresil decât în cazul albastrului de metilen nou, conform comparației metodelor de colorare publicate în PMC. Concluzia justificată pentru studenți: utilizați albastrul de metilen nou drept comparator manual standardizat, verificați orice metodă locală cu albastru briliant de cresil prin comparație cu acesta sau cu o metodă automatizată și așteptați-vă la o dispersie mai mare a rezultatelor microscopiei manuale în ambele cazuri. Literatura mai veche privind standardizarea recomanda și Azure B purificat ca alternativă mai pură din punct de vedere chimic, deoarece loturile de coloranți comerciali variau, în studiul Marshall despre Azure B, ceea ce explică de ce gradul de puritate al reactivului apare încă în discuțiile despre metode.

Evitarea greșelilor obișnuite

Patru greșeli explică majoritatea preparatelor nereușite. Comandarea albastrului de metilen obișnuit în locul albastrului de metilen nou N produce o colorare slabă din motive chimice, nu tehnice. Fixarea sau contracolorarea înainte de examinare elimină semnalul supravital. Numărarea precipitatului de colorant drept granule supraestimează rezultatul, lucru prevenit de regula celor două granule și de filtrarea colorantului. Numărarea unui număr prea mic de celule la procente scăzute de reticulocite produce o valoare aparent precisă, dar cu limite de încredere largi. Fiecare eroare are aceeași semnătură: microscopistul dă vina pe microscop pentru ceea ce a fost deja determinat în etapa de utilizare a reactivului.