Albastrul de metilen ca indicator de anaerobioză și oxigen: ce dovedește schimbarea culorii

O tehniciană etanșează un recipient pentru anaerobioză, verifică banda indicatoare cu albastru de metilen prin capac și vede ceea ce spera să vadă. Banda a trecut de la albastru la alb. Consemnează că procedura s-a desfășurat în condiții anaerobe și trece mai departe. Două zile mai târziu, pe o placă nu crește nimic, în timp ce o eprubetă etanșată cu mediu de cultură lichid, aflată în același recipient, prezintă semne de expunere la oxigen. Banda spunea adevărul. Tehniciana îi pusese întrebarea greșită.

Confuzia este una conceptuală. Un indicator de anaerobioză cu albastru de metilen se bazează pe un concept redox, nu pe un concept de sterilitate și nici pe validarea întregului sistem. Odată clarificată această distincție, banda devine un instrument precis și onest, cu un rol bine delimitat.

Conceptul: un cuplu redox reversibil

Albastrul de metilen dizolvat există în două stări. Forma oxidată este cationul albastru bine cunoscut. Forma redusă, numită leucoalbastru de metilen, este incoloră. La un pH apropiat de cel neutru, semireacția simplificată constă în combinarea unui cation albastru cu un proton și doi electroni, rezultând o moleculă leuco incoloră. Potențialul formal este de aproximativ plus 11 milivolți față de electrodul standard de hidrogen la pH 7, ceea ce îl plasează într-un interval accesibil multor sisteme reducătoare și în care oxigenul poate inversa reacția.

Reducerea necesită un potențial redox local scăzut. Simpla eliminare a oxigenului nu este întotdeauna suficientă. Primele cercetări privind anaerobioza au constatat că albastrul de metilen din apă simplă, lipsită de oxigen, își păstra culoarea dacă nu era prezentă o substanță reducătoare și că amestecurile de mediu lichid cu dextroză și aproximativ 0.01 procente colorant se decolorau ușor la 37 C, în timp ce același amestec păstrat la 4 C rămânea albastru timp de o zi, conform experimentelor pe țesut proaspăt și în condiții de cultură anaerobă. Temperatura, pH-ul, glucoza, ascorbatul, tioglicolatul și activitatea reducătoare microbiană determină disponibilitatea electronilor.

Reoxidarea necesită doar oxigen. Când aerul ajunge la forma leuco, aceasta redevine albastră. Indicatorii moderni concepuți special exploatează exact acest ciclu: colorant plus agent reducător plus o matrice stabilizatoare, incolori la un nivel scăzut de oxigen și din nou albaștri la expunerea la aer, după cum demonstrează un indicator hibrid de oxigen cu albastru de metilen, bazat pe colorant, agent reducător, surfactant și argilă. Acel prototip folosea colorant la o concentrație de 0.01 milimolari, cu ascorbat sau glucoză la 2.0 milimolari și pH 11, devenea incolor la aproximativ 0.5 procente de oxigen în volum și diferenția concentrațiile sub 0.1 procente de cele peste 0.5 procente de oxigen în camera sa de testare.

Prin urmare, principiul de funcționare este simplu. Albastru înseamnă că zona indicatorului este oxidată. Incolor înseamnă că zona indicatorului a ajuns la condiții reducătoare, cu un nivel scăzut de oxigen. Schimbarea este reversibilă, locală și chimică. Luată separat, nu spune nimic despre microorganisme.

Cum funcționează o bandă indicatoare cu albastru de metilen într-un recipient pentru anaerobioză

O bandă indicatoare cu albastru de metilen pentru un recipient de anaerobioză este o mică zonă de reacție plasată în atmosfera recipientului, unde poate fi văzută fără deschiderea acestuia. Formatele comerciale diferă: benzi de hârtie, comprimate dizolvate sau umezite la pregătire și hârtii hibride mai noi. Unele necesită o picătură de apă distilată pentru activarea zonei de reacție. Altele sunt dispozitive în format uscat, care trebuie să rămână uscate. Instrucțiunile produsului respectiv au prioritate, deoarece hidratarea, amplasarea și momentul citirii fac parte din mecanismul chimic.

În practică, interpretarea prevăzută este binară. Albastru înseamnă că la nivelul benzii persistă oxigenul sau condiții insuficient de reducătoare. Alb sau incolor înseamnă că la nivelul benzii s-au stabilit condiții redox anaerobe. Unele hârtii comerciale conțin și un pigment roșu de fond, astfel încât starea finală redusă apare roz, nu albă. Aflați ce culoare finală indică produsul dumneavoastră înainte de a-l evalua.

Timpul variază în funcție de sistem. Într-o configurație de tip GasPak, decolorarea a început în aproximativ o oră și s-a încheiat în câteva ore, în timp ce într-o comparație controlată la temperatura camerei, albastrul de metilen a necesitat peste șase ore. Potențialul redox al mediilor din acel studiu a ajuns la aproximativ minus 100 milivolți în 60 până la 100 minute, cu mult înainte ca schimbarea culorii să se încheie, și era mult sub minus 200 milivolți când banda a devenit complet incoloră. Indicatorul răspunde cu întârziere față de schimbările atmosferei. O bandă albastră după o oră nu dovedește un eșec, iar o bandă albă după șase ore descrie starea benzii la acel moment.

Amplasarea contează din același motiv. Păstrați banda în spațiul de gaz de deasupra culturilor, vizibilă prin capac, departe de suprafețele de agar și de mediile de cultură. Ea indică starea mediului său imediat. Dacă o așezați lipită de un perete rece, o acoperiți cu plăci sau o lăsați să se îmbibe cu condens, va indica starea acelui micromediu, nu a recipientului.

Ce arată banda și ce nu arată

Gândiți-vă la indicatorul cu albastru de metilen din recipientul pentru anaerobioză ca la un singur senzor într-un singur loc. El stabilește condițiile locale de redox și oxigen din propria zonă de reacție, în general reprezentative pentru spațiul de gaz dacă amestecarea și echilibrarea sunt adecvate. Orice concluzie dincolo de aceasta este o inferență, iar inferența necesită dovezi separate.

O bandă incoloră nu stabilește sterilitatea. Sterilitatea înseamnă absența organismelor viabile, demonstrată prin sterilizare validată și controale de validare a culturilor. Un recipient poate fi complet anaerob și totuși contaminat sau complet steril și totuși aerob.

Banda nu validează fiecare componentă a sistemului de cultură. Oxigenul dizolvat într-o eprubetă etanșată, oxigenul prins în profunzimea agarului, gradienții dintr-un recipient aglomerat și o scurgere apărută după citire nu pot fi detectate toate de o singură bandă. Experimentele privind distribuția spațială au arătat zone albastre și incolore alăturate în același vas, în care pătrunderea oxigenului și activitatea reducătoare se echilibrau diferit. Un singur punct nu poate certifica un volum.

Banda nu dovedește o anaerobioză neîntreruptă. O bandă citită o singură dată la pregătirea sistemului nu spune nimic despre ora douăzeci. Cercetările recente privind calitatea condițiilor anaerobe avertizează că indicatorii chimici descriu atmosfera în momentul citirii și pot arăta satisfăcător chiar dacă mai există cantități mici de oxigen rezidual. Documentarea continuă sau la puncte de control, nu o singură privire la starea finală, este cea care leagă indicația benzii de perioada de incubare.

Pentru detalii despre chimia schimbării culorii, consultați cum trece albastrul de metilen între stările oxidată și redusă. Pentru o perspectivă mai largă asupra modului în care oxigenul influențează manipularea probelor, consultați controlul oxigenului în microscopie și în lucrul cu culturi.

O diagramă de păstrat lângă recipient

Figura de mai jos rezumă articolul într-un material de referință pentru masa de laborator. Prezintă trei stări ale aceleiași benzi, cele două sensuri ale reacției și limita dintre dovezile oferite de indicator și validarea sistemului.

Cauze de eșec care mențin banda albastră sau oferă o falsă siguranță

Majoritatea eșecurilor se încadrează în cinci grupe. Fiecare are semne distincte.

Un recipient sau o pungă neetanșă continuă să aducă oxigen în zona de reacție. Banda rămâne albastră sau redevine albastră după decolorare. Verificați capacul, garnitura, clemele și suprafețele de etanșare înainte de a învinui chimia.

Un generator de gaz epuizat sau activat incorect nu elimină oxigenul. În sistemele mai vechi activate cu apă, lipsa condensului după aproximativ 10 până la 15 minute și absența încălzirii capacului după aproximativ 20 până la 40 minute erau semne timpurii de avertizare pentru acel sistem. Un plic cu o capacitate insuficientă într-un recipient supraîncărcat eșuează în același mod.

Intoxicarea catalizatorului este relevantă doar pentru sistemele mai vechi cu hidrogen și paladiu, în care paladiul favorizează combinarea hidrogenului cu oxigenul pentru a forma apă. Umiditatea și hidrogenul sulfurat îl degradează. Multe plicuri actuale nu folosesc deloc paladiu, așadar nu aplicați această măsură de remediere acolo unde nu este relevantă.

O bandă degradată sau manipulată greșit poate eșua fără semne evidente. Colorantul și agentul reducător își pierd reversibilitatea în timpul depozitării, acesta fiind unul dintre motivele pentru care au fost dezvoltate formule hibride rezistente la decolorarea provocată de lumină și la degradarea în timpul depozitării. Respingeți stocurile expirate, produsele cu o culoare inițială anormală și benzile umezite când ar trebui să fie uscate sau lăsate uscate când necesită umezire.

Un gradient sau o întârziere induce în eroare persoana care citește indicatorul, fără ca mecanismul chimic să fie defect. Spațiul de gaz insuficient amestecat, eprubetele etanșate cu oxigen dizolvat și mediile semisolide își păstrează fiecare propriile condiții mai mult decât sugerează banda. Benzile cu resazurină trec prin roz înainte de a deveni incolore și sunt adesea comercializate ca fiind mai rapide, dar pragurile lor sunt specifice propriei formule și nu se aplică albastrului de metilen.

Controale și un protocol de citire care merită preluat

Două controale ieftine detectează majoritatea interpretărilor greșite. Păstrați o bandă martor nouă în aerul încăperii, în paralel cu procedura. O bandă funcțională cu albastru de metilen rămâne albastră acolo. Unii indicatori ambalați sunt inițial palizi și devin albaștri la deschidere, ceea ce constituie în sine o verificare funcțională. De asemenea, introduceți periodic o bandă nouă într-un sistem anaerob validat anterior. Ea ar trebui să ajungă la starea finală redusă validată în timpul specificat pentru produs. Dacă oricare dintre controale nu se comportă corespunzător, înlocuiți lotul înainte de a vă baza pe citirile din recipient.

Protocolul de citire decurge din mecanism. Amplasați banda în spațiul de gaz, într-un loc vizibil fără deschiderea recipientului, respectând instrucțiunile produsului privind contactul cu peretele și umezirea. Consemnați culoarea inițială, ora la care recipientul a fost etanșat și culoarea la punctul de control specificat pentru produs. Dacă vasul permite, consemnați faptul că indicatorul a rămas redus la puncte de control definite pe durata incubării. Înregistrați culoarea finală imediat înainte de deschidere. Această culoare de dinaintea deschiderii este rezultatul final pentru procedura respectivă. După deschidere, așteptați-vă la reapariția culorii albastre și nu o lăsați să rescrie istoricul.

Dacă banda rămâne albastră după timpul specificat, considerați anaerobioza neconfirmată. Verificați succesiv: etanșarea, plicul, catalizatorul dacă există, hidratarea și termenul de valabilitate al indicatorului, apoi funcționarea indicatorului prin comparație cu martorul expus la aer. Numai după verificarea atmosferei trebuie interpretată prezența sau absența creșterii, folosind o configurație de cultură anaerobă și controale pentru microorganisme adecvate aplicației.

Banda merită să aibă ultimul cuvânt în propriul domeniu. Albastră sau incoloră, ea răspunde la o singură întrebare despre un singur loc, într-un singur moment. Puneți-i acea întrebare la momentele stabilite, cu martorii alături, și va răspunde fiabil. Întrebați-o despre sterilitate, despre fiecare eprubetă sau despre întreaga incubare pe baza unei singure priviri, iar niciun mecanism chimic al indicatorului nu poate salva interpretarea.