De ce se folosește albastrul de metilen ca contracolorant în colorația pentru acid-alcoolo-rezistență

Un tehnician examinează un frotiu de spută după întreaga secvență de colorare. Bastonașele roșii ies în evidență pe un câmp albastru, iar raportul consemnează prezența bacililor acid-alcoolo-rezistenți. A doua zi, o altă lamă prezintă un câmp albastru uniform, fără bastonașe roșii, iar rezultatul este raportat ca negativ pentru tuberculoză. Unul dintre aceste rapoarte afirmă mai mult decât susține lama, și nu este primul.

Confuzia este conceptuală. Tehnicianul a tratat colorantul albastru ca pe o parte a chimiei de detectare, ca și cum albastrul de metilen ar fi ajutat la identificarea micobacteriilor. Nu a făcut-o. Când albastrul de metilen ajunge pe lamă, testul s-a încheiat deja. Colorantul colorează doar fundalul, astfel încât rezultatul să poată fi citit. Acest articol explică rolul albastrului de metilen în colorația pentru acid-alcoolo-rezistență, de ce este albastru și nu de altă culoare și ce concluzii permite contrastul dintre roșu și albastru.

Răspunsul pe scurt

Colorația pentru acid-alcoolo-rezistență este un test diferențial construit pe trei principii. Fucsina fenicată, colorantul primar, este forțată să pătrundă în fiecare celulă, inclusiv în micobacteriile cu înveliș ceros. Acid-alcoolul, agentul de decolorare, îndepărtează colorantul roșu din celulele obișnuite, dar nu reușește să îl extragă din cele acid-alcoolo-rezistente. Albastrul de metilen, contracolorantul, colorează apoi tot ceea ce agentul de decolorare a lăsat fără colorant, astfel încât celulele care nu sunt acid-alcoolo-rezistente, celulele gazdei și resturile apar albastre, în timp ce bacilii acid-alcoolo-rezistenți rămân roșii. Contracolorantul asigură contrastul. Nu participă la chimia care face o celulă acid-alcoolo-rezistentă.

Ce face fiecare etapă

Diagrama de mai jos arată împărțirea rolurilor. Citește-o de la stânga la dreapta ca pe o procedură, iar banda de jos ca pe un memento că fiecare familie de colorații răspunde unei întrebări diferite.

Pătrunderea este prima etapă. Micobacteriile rezistă coloranților apoși obișnuiți deoarece învelișul lor este neobișnuit de hidrofob, așa că protocolul forțează pătrunderea. În metoda Ziehl-Neelsen, încălzirea până la apariția vaporilor împinge fucsina fenicată, care conține fenol, prin peretele ceros. În metoda Kinyoun la rece, încălzirea este înlocuită cu o formulă mult mai concentrată a colorantului primar, iar unele variante modificate fără încălzire adaugă surfactanți. Protocoalele de colorație pentru acid-alcoolo-rezistență ale American Society for Microbiology documentează ambele formule în paralel, iar diferența de concentrație este izbitoare: aproximativ 0.3 g de fucsină bazică la 100 mL pentru metoda cu încălzire, față de aproximativ 4 g pentru metoda la rece.

Diferențierea este a doua etapă. Acid-alcoolul, de obicei 3 mL de acid clorhidric concentrat în 97 mL de etanol de 95 la sută, îndepărtează prin spălare colorantul roșu din fiecare celulă al cărei perete nu oferă o rezistență specială. Celulele cu învelișul lipidic micobacterian intact păstrează colorantul. Aceasta este etapa de care depinde întreaga metodă și cea mai sensibilă la tehnica de lucru, după cum se discută mai jos.

Contrastul vine la final. Lama conține acum celule acid-alcoolo-rezistente roșii pe un fundal aproape incolor de celule decolorate. Albastrul de metilen la 0.3 la sută w/v redă vizibilitatea acelui fundal într-o culoare cât mai îndepărtată de roșu. Contracolorarea este scurtă, de obicei 20 până la 30 de secunde în metoda cu încălzire și până la câteva minute în unele variante ale metodei la rece, iar durata depinde de protocol, nu de o proprietate a colorantului în sine.

De ce acest colorant și de ce albastru

Albastrul de metilen este un colorant bazic cationic, ceea ce înseamnă că ionul său colorat poartă o sarcină pozitivă și se leagă de suprafețele încărcate negativ ale bacteriilor decolorate, celulelor gazdei și resturilor. OpenStax Microbiology descrie această logică a sarcinilor drept principiul general al coloranților bazici. Dar albastrul de metilen nu este unic din punct de vedere chimic în acest context. Violetul de cristal și safranina sunt tot coloranți bazici. Alegerea este optică, nu chimică.

Bastonașele roșii au nevoie de un fundal într-o nuanță contrastantă, iar albastrul se opune roșului în modul cel mai util pentru microscopia în câmp luminos. Safranina ar fi un contracolorant nepotrivit deoarece culoarea sa finală roz-roșie este prea apropiată de fucsina fenicată reținută, anulând tocmai distincția creată de procedură. Violetul de cristal ar produce un fundal violet închis care ar concura cu bacilii roșii subțiri pentru atenție. Cea mai puternică dovadă că rolul este contrastul, nu chimia, este posibilitatea de înlocuire: contracoloranți verzi, precum verdele de malachit și verdele briliant, sunt utilizați în unele protocoale veterinare și modificate, iar testul funcționează în continuare, deoarece orice nuanță clar diferită îndeplinește același rol.

De aici rezultă două consecințe practice. În primul rând, rețeta standard nu prevede ajustarea pH-ului; nu confunda această soluție apoasă simplă de 0.3 la sută cu formule alcaline precum albastrul de metilen Loeffler, care aparțin unui alt concept de colorare. În al doilea rând, excesul dăunează. Literatura de histologie avertizează în mod explicit că un fundal albastru prea intens poate masca bacilii puțin numeroși, astfel încât menținerea lamei acoperite cu colorant mai mult decât permite protocolul sacrifică lizibilitatea fără niciun beneficiu.

Chimia peretelui care face posibil testul

Motivul pentru care acid-alcoolul diferențiază celulele se află în învelișul micobacterian. Nucleul său structural este complexul micolil-arabinogalactan-peptidoglican: peptidoglican legat de arabinogalactan, ale cărui capete exterioare poartă acizi micolici cu lanțuri foarte lungi, formând o micomembrană externă bogată în lipide, cu o permeabilitate neobișnuit de scăzută. Sinteza despre membrana externă micobacteriană detaliază această arhitectură. Bariera funcționează în ambele sensuri. Se opune pătrunderii colorantului, motiv pentru care pătrunderea necesită încălzire sau un colorant primar mai concentrat, și se opune extragerii colorantului, motiv pentru care acid-alcoolul nu reușește să îndepărteze fucsina fenicată odată ce aceasta a pătruns. Bacteriile obișnuite nu au acest înveliș și pierd colorantul. Prin urmare, acid-alcoolo-rezistența este înțeleasă cel mai bine ca un fenomen de barieră lipidică, nu ca o legare chimică a fucsinei de acidul micolic.

Această chimie explică și o nedumerire frecventă: micobacteriile se colorează slab și imprevizibil prin metoda Gram, apărând uneori ca forme slab colorate, cu aspect de șirag de mărgele, sau ca siluete necolorate. Peretele lor hidrofob limitează pătrunderea violetului de cristal. Colorația pentru acid-alcoolo-rezistență nu este o colorație Gram modificată. Este un alt principiu de diferențiere, construit în jurul unei alte proprietăți a peretelui, așa cum arată comparația dintre colorația simplă și colorația Gram pentru celelalte două metode.

Trei metode, trei întrebări

Pentru familia mai largă de metode bacteriene cu un singur colorant, consultă atlasul colorațiilor pentru microscopie.

Ce nu poate demonstra contrastul dintre roșu și albastru

Bastonașele roșii înseamnă că microorganismele au reținut fucsina fenicată după expunerea la acid-alcool. Această constatare este compatibilă cu Mycobacterium tuberculosis, dar ghidul CDC pentru diagnosticul tuberculozei precizează explicit că și alte micobacterii sunt acid-alcoolo-rezistente, astfel încât identificarea speciei necesită cultură și teste pentru acizi nucleici, nu culoare.

Erorile de tehnică se concentrează în jurul celor două spălări. Decolorarea insuficientă lasă materialul de fundal roșu și favorizează interpretări fals pozitive. Decolorarea excesivă îndepărtează colorantul primar slab reținut și contribuie la rezultate fals negative. Un contracolorant aplicat în exces ascunde bacilii puțin numeroși în albastru. Frotiurile groase, reactivii precipitați și apa de clătire contaminată adaugă propriile artefacte.

Sensibilitatea este limitată de încărcătura de microorganisme, indiferent cât de corectă este tehnica. Microscopia convențională a frotiului necesită aproximativ 5,000 până la 10,000 de bacili per mililitru de spută, iar sinteze mai vechi ale dovezilor realizate de CDC estimau sensibilitatea frotiului la aproximativ 45 până la 80 la sută în rândul cazurilor pulmonare confirmate prin cultură. Prin urmare, un frotiu negativ nu exclude niciodată tuberculoza. Ghidul actual CDC menține cultura alături de fiecare frotiu și recomandă testarea prin amplificarea acizilor nucleici pe cel puțin o probă respiratorie atunci când se ia în considerare tuberculoza pulmonară, iar rezultatul ar modifica conduita.

Lucrul practic trebuie să urmeze protocoale autorizate

Descrierile didactice, inclusiv acest articol, nu autorizează activitatea clinică. Pentru lucrul la bancul de laborator, urmează procedura operațională standard validată a laboratorului, aliniată la documentele actuale CDC, APHL sau CLSI; documentul de referință CDC privind colorația pentru acid-alcoolo-rezistență, păstrat în arhiva Stacks, arată cum asemenea proceduri specifică reactivii și interpretarea rezultatelor. Lucrul cu probe pentru tuberculoză necesită măsuri de izolare biologică: frotiurile se prepară într-o hotă de siguranță biologică deoarece prepararea generează aerosoli și stropi, iar ghidul CDC de siguranță în laborator precizează că și frotiurile fixate prin căldură pot conține bacili tuberculoși viabili și trebuie în continuare manipulate ca materiale contaminate. Înregistrarea din CDC Public Health Image Library pentru un frotiu colorat cu fucsină fenicată și albastru de metilen, examinat pentru M. leprae, este un memento util al aplicabilității metodei dincolo de tuberculoză: același contrast roșu pe albastru este folosit oriunde se caută microorganisme acid-alcoolo-rezistente, iar o interpretare negativă atentă este, în sine, un rezultat care merită consemnat.

Citirea lamei finalizate

Contracolorantul își dovedește utilitatea în timpul examinării preliminare. Un microscopist care parcurge lama la mărire mică folosește mai întâi fundalul albastru pentru a evalua calitatea frotiului: distribuție uniformă a celulelor, celule intacte ale gazdei pentru focalizare, absența unui precipitat abundent. Structurile roșii suspecte atrag apoi privirea tocmai pentru că nimic altceva de pe lamă nu este roșu. Confirmarea are loc la imersie în ulei, unde bacilii adevărați prezintă aspectul așteptat de bastonașe subțiri, uneori ușor curbate sau cu aspect de șirag de mărgele, nu de resturi uniforme de colorant.

Colorarea fundalului stabilește și vocabularul raportului. O lamă cu bacili roșii este raportată ca având bacili acid-alcoolo-rezistenți observați, adesea cu un grad semicantitativ conform scalei laboratorului. O lamă fără microorganisme roșii este raportată ca fără bacili acid-alcoolo-rezistenți observați, niciodată ca negativă pentru tuberculoză. Distincția contează deoarece câmpul albastru demonstrează că procesul de colorare a funcționat, celulele au preluat contracolorantul și condițiile optice au fost adecvate, fără să spună nimic despre microorganismele aflate sub limita de detectare. Un câmp albastru fără bacili vizibili este un rezultat valid despre lamă, nu un verdict despre pacient.

Ține minte împărțirea rolurilor, iar rapoartele devin ușor de formulat. Fucsina fenicată detectează structurile candidate. Acid-alcoolul efectuează testul. Albastrul de metilen doar face răspunsul lizibil: roșul a păstrat colorantul în prezența acidului, albastrul l-a pierdut. Tot restul — specia, încărcătura și semnificația clinică — provine din investigații care depășesc examinarea lamei.