Explicații despre coloranții cu albastru de metilen alcalin Loeffler și policrom

Pe o masă de colorare pot sta alăturate trei flacoane, fiecare etichetat cu o variantă de albastru de metilen. Pe unul scrie albastru de metilen apos 1%. Pe altul scrie albastru de metilen alcalin Loeffler. Pe al treilea scrie albastru de metilen policrom. Un lucrător ocupat îl ia pe cel mai apropiat. Frotiul se colorează apoi prea slab, prea uniform în albastru sau în nuanțe neașteptate de violet, iar vina pentru rezultat este pusă pe probă.

Aceasta este o problemă de formulă, nu de probă. Cele trei soluții conțin coloranți înrudiți, dar se bazează pe concepte de colorare diferite. Una este un colorant cationic simplu, la un pH aproape neutru. Alta este același colorant, a cărui acțiune este intensificată prin alcalinizare. A treia nu mai este deloc un singur colorant, ci un amestec oxidat deliberat. Dacă folosiți soluția greșită, principiul de colorare se schimbă chiar în timpul lucrului.

Răspunsul pe scurt

Albastrul de metilen apos simplu este varianta de referință: aproximativ 1% colorant în apă, un colorant cationic simplu pentru morfologia bacteriană și microscopia generală. Albastrul de metilen alcalin Loeffler adaugă o cantitate mică, măsurată, de soluție alcalină diluată la o soluție-mamă alcoolică diluată în apă, ceea ce crește pH-ul și favorizează legarea colorantului cationic de structurile bacteriene acide. Albastrul de metilen policrom este albastru de metilen maturat deliberat prin oxidare în mediu alcalin, astfel încât flaconul conține un amestec de omologi demetilați (azure A, azure B, azure C), tionină și violet de metilen, alături de albastru de metilen rezidual, iar acest amestec colorează structuri diferite în nuanțe diferite.

Dacă rețineți o singură propoziție: alcalinizarea schimbă intensitatea colorării, în timp ce policromizarea schimbă culorile obținute.

Albastrul de metilen apos obișnuit: punctul de referință

Cea mai simplă formulă este albastrul de metilen dizolvat în apă, de obicei la 1% w/v, fără alcalinizare și fără oxidare. Specia colorată este cationul metiltioniniu, cu un contraion clorură, un colorant fenotiazinic mic și plan, descris în fișa PubChem pentru albastrul de metilen drept clorură de metiltioniniu. Fiind un cation, se leagă de scheletul fosfat al acizilor nucleici și de grupările acide de pe pereții celulari bacterieni, colorând celulele în albastru pe un fundal deschis.

Avantajul său este predictibilitatea. Nucleii și bacteriile apar albastre. Contrastul este modest. Microorganismele slab vizibile se pot colora insuficient, iar aceasta este exact limita pe care Loeffler și-a propus să o depășească. Pentru familia mai largă de colorări bacteriene simple din care face parte această soluție, consultați o prezentare generală a colorării bacteriene simple. Verificarea riguroasă a identității rămâne importantă și aici: albastrul de metil este o moleculă complet diferită, după cum explică articolul despre albastrul de metil comparat cu albastrul de metilen, astfel încât o căutare în catalog bazată doar pe denumirea culorii poate duce la alegerea unei clase greșite de coloranți.

Albastrul de metilen alcalin Loeffler: același colorant, cu acțiune intensificată

Rețeta clasică Loeffler combină o soluție-mamă alcoolică de albastru de metilen cu o soluție alcalină diluată în apă. Variantele din manuale prevăd 0.3 g de colorant în 30 mL de etanol 95%, plus 100 mL de soluție apoasă de hidroxid de potasiu 0.01% (sau, echivalent, 30 mL de soluție alcoolică saturată de albastru de metilen, 100 mL de apă distilată și 1 mL de KOH 1%), obținându-se o soluție de lucru cu aproximativ 0.3% colorant, la un pH clar alcalin. Variantele comerciale urmează același principiu, iar catalogul Thermo Fisher de coloranți pentru microbiologie prezintă albastrul de metilen alcalin Loeffler alături de variantele policromă și apoasă ca produse de catalog separate, cu utilizări prevăzute distincte.

Alcalinizarea este principiul esențial. Creșterea pH-ului deprotonează grupările carboxil și fosfat din preparat, mărind densitatea situsurilor cu sarcină negativă, în timp ce soluția-mamă alcoolică menține colorantul complet dizolvat, astfel încât acesta ajunge la acele situsuri în formă monomerică. Rezultatul este o colorare a bacteriilor mai rapidă și mai intensă decât cea obținută cu un colorant apos neutru, cu bastonașele și cocii de un albastru intens caracteristici unui frotiu bacteriologic obișnuit. Timpul de colorare este de obicei de unu până la trei minute, urmat de o clătire cu apă.

Aplicația clasică este Corynebacterium diphtheriae cultivată pe mediul cu ser Loeffler: bastonașe subțiri, adesea cu aspect de măciucă, cu granule metacromatice Babes-Ernst intens colorate, formate din polifosfat stocat. Asocierea dintre mediu și colorant este istorică, ambele fiind atribuite aceluiași bacteriolog, iar contrastul granulelor reprezintă avantajul diagnostic. Dincolo de lucrările privind difteria, colorantul este folosit ca colorant bacteriologic general pentru frotiuri din culturi, pentru morfologia Neisseria în frotiuri clinice și oriunde colorarea Gram nu este necesară, dar albastrul apos simplu se dovedește prea slab. Este un colorant monocrom. Tot ce este acid capătă o nuanță de albastru. Când un protocol cere diferențiere prin culoare, alcalinizarea singură nu o poate asigura.

O precauție practică: soluțiile alcaline de coloranți se degradează și precipită în timpul depozitării și prin absorbția dioxidului de carbon. Laboratoarele fie prepară volume mici, fie cumpără soluția din catalog și îi respectă termenul de valabilitate, în loc să păstreze cu orice preț un flacon vechi care depune acum sediment pe fiecare lamă.

Albastrul de metilen policrom: o singură denumire, mai mulți coloranți

Albastrul de metilen policrom pornește de la același colorant, dar îl supune unei oxidări controlate în mediu alcalin, numită istoric maturare sau policromizare. Maturarea în mediu alcalin, încălzirea cu carbonat sau oxidarea cu agenți precum dicromatul îndepărtează treptat grupările metil din substituenții dimetilamino. Produsul este un amestec: albastru de metilen rezidual plus azure B (o grupare metil îndepărtată), azure A și azure C (demetilare suplimentară), tionină (complet demetilată) și produși secundari de oxidare din familia violetului de metilen. Fiecare componentă are propria nuanță și afinitate pentru țesuturi, astfel încât amestecul colorează metacromatic: nucleii, granulele, mucinele și cartilajul capătă fiecare tonuri distincte, de la albastru la roșu-violet.

Această chimie este aceeași care stă la baza celebrelor colorări ale sângelui. Primii cercetători au constatat că albastrul de metilen alcalinizat colora nucleii paraziților malariei în nuanțe de violet, dar soluțiile lor apoase maturate erau instabile și precipitau în câteva zile. Analiza despre cum a fost inventată colorarea violetă a sângelui urmărește modul în care Malachowski și Romanowsky au valorificat independent acest efect în 1891, cum a fost introdus metanolul pentru a stabiliza precipitatul de colorant și a fixa frotiurile fără căldură și cum Giemsa a standardizat ulterior amestecul folosind cantități măsurate de azure B și eozină, cu stabilizare prin glicerol. Coloranții moderni de tip Giemsa derivă direct din albastrul de metilen policrom combinat cu eozină, combinația care produce efectul Romanowsky. Pentru detalii despre asocierea cu eozina și componenta azure B, consultați coloranții de tip Romanowsky și interacțiunea dintre azure B și eozină.

Fiind un amestec, albastrul de metilen policrom este, prin natura sa, cel mai puțin standardizat dintre cele trei. Echilibrul exact al nuanțelor depinde de metoda și gradul de oxidare, motiv pentru care furnizorii de produse pentru histologie îl vând ca produs distinct, cu propriile teste de performanță, nu ca soluție Loeffler îmbătrânită. Utilizările tipice includ evidențierea metacromatică a granulelor mastocitelor, a mucinelor și a cartilajului, evidențierea detaliilor plasmocitelor și a Helicobacter pylori în secțiuni tisulare prin metode policrome de tip Goodpasture. Este alegerea potrivită când se urmărește diferențierea prin culoare și alegerea greșită când protocolul cere un contur bacterian clar, monocrom.

Compararea formulelor și a scopurilor

Citiți tabelul ca pe un ghid de decizie. Dacă preparatul se colorează prea slab, schimbați abordarea privind pH-ul și alegeți Loeffler. Dacă totul se colorează, dar nimic nu se diferențiază, schimbați abordarea privind colorantul și alegeți varianta policromă. Dacă un frotiu colorat cu Loeffler evidențiază foarte bine granulele, dar responsabilul întreabă de ce nucleii și citoplasma au același albastru, răspunsul este că niciun colorant alcalin monocrom nu poate realiza acea diferențiere. Această cerință ține de familia policromă și de derivații săi pentru colorarea sângelui.

Evitarea confuziilor obișnuite

Două erori explică cea mai mare parte a confuziei. Prima este considerarea soluției Loeffler drept interschimbabilă cu albastrul de metilen simplu, deoarece ambele arată albastre în flacon. Ele diferă prin pH și intensitate, iar înlocuirea soluției Loeffler cu un colorant neutru acolo unde este specificată duce la pierderea exact a contrastului granulelor pe care se bazează protocolul. A doua este considerarea oricărei soluții alcaline albastre vechi sau îmbătrânite accidental drept policromă. Îmbătrânirea necontrolată produce un amestec necunoscut, cu o putere de colorare necunoscută, în timp ce soluțiile policrome propriu-zise sunt preparate prin metode de oxidare definite și, în familia coloranților pentru sânge, combinate cu cantități măsurate de eozină. Istoria oferă aici o lecție: soluțiile apoase maturate și instabile din anii 1890 au fost înlocuite de formule metanolice stabilizate tocmai pentru că amestecurile necontrolate nu puteau fi reproduse, o lecție care merită amintită înainte de a colora o lamă de diagnostic folosind un flacon de vechime incertă.

Rigoarea în privința denumirilor completează această abordare. Confirmați produsul din catalog (apos, Loeffler sau policrom), conținutul de colorant și aplicația prevăzută de pe etichetă, în loc să le deduceți din culoare. Cele trei formule au un precursor cromoforic comun. Nu au un scop comun.