Azul de metileno e hormese: porque as curvas dose-resposta podem mudar de direção

Um rato recebe 4 miligramas por quilograma de azul de metileno depois de aprender a reconhecer um objeto e, no dia seguinte, lembra-se dele. Outro rato recebe 50 e quase não faz girar a roda de exercício. A molécula é a mesma. A direção do efeito não é. Quem tenha lido mais do que alguns artigos sobre azul de metileno já encontrou esta inversão, e ela tem um nome: hormese, uma resposta bifásica em que exposições baixas e altas empurram o mesmo parâmetro de avaliação em direções opostas.

O nome só é útil se soubermos o que promete e o que não promete. Este artigo percorre quatro conjuntos de dados publicados sobre azul de metileno, cada um com o seu próprio parâmetro de avaliação, intervalo de concentrações e configuração experimental, e mostra porque a química do corante torna plausíveis estas inversões. Termina com o aviso imposto pelos dados: uma curva que atinge um pico numa experiência descreve essa experiência; não é um método para escolher uma dose pessoal.

O padrão tem um nome, e o significado desse nome é mais restrito do que parece

O termo hormese foi cunhado em 1943 por Southam e Ehrlich e recebeu a sua forma quantitativa moderna com Calabrese e Baldwin: uma resposta adaptativa bifásica, produzida diretamente ou por compensação depois de a homeostase ser perturbada. Repare no que falta nesta definição. A palavra benéfico não aparece. Hormese significa que a curva muda de direção, nada mais.

A forma observada depende do parâmetro colocado no eixo vertical. Quando o parâmetro é uma função positiva, como atividade enzimática, consumo de oxigénio ou pontuação de memória, uma estimulação a dose baixa seguida de inibição a dose alta desenha um U invertido. Quando o parâmetro é algo negativo, como a incidência de doença, uma supressão a dose baixa seguida de aumento a dose alta desenha um J ou um U. A mesma relação, uma ordenada diferente. A maioria dos trabalhos sobre azul de metileno mede funções positivas, pelo que este artigo fala em curvas em U invertido, entendendo-se que a letra do alfabeto resulta de uma escolha de representação gráfica.

A revisão de 2008 que reuniu as respostas horméticas do azul de metileno torna concreta a escala. Em parâmetros comportamentais, fisiológicos e bioquímicos, as respostas dentro da zona de estimulação atingem aproximadamente 130 a 160 por cento do controlo, com uma média próxima de 140, antes de regressarem ao nível de controlo e depois caírem abaixo dele à medida que a dose continua a aumentar. Esse intervalo resume muitas experiências; não é uma propriedade da molécula. Cada curva abaixo tem o seu próprio pico nas suas próprias unidades.

Porque esta molécula, em particular, pode inverter o efeito

O azul de metileno não é um simples dador de eletrões. É um transportador reversível. A forma azul oxidada aceita eletrões, transformando-se na forma reduzida incolor, e a forma reduzida pode depois transferir esses eletrões mais adiante. O relé eletrónico por detrás destas curvas é descrito na explicação de como o azul de metileno transporta eletrões, e esse transporte é o ponto central aqui.

Em concentrações baixas, esse ciclo oferece à respiração uma via alternativa. O corante reduzido pode ser oxidado na citocromo oxidase, a enzima terminal da cadeia de transporte de eletrões, aumentando a sua atividade juntamente com o consumo de oxigénio e a capacidade respiratória. Em concentrações mais elevadas, a mesma química ávida por eletrões começa a competir com a cadeia normal em vez de a auxiliar: desvia eletrões da sua rota habitual, consome oxigénio diretamente e gera espécies reativas de oxigénio em vez de energia produtiva. Um pequeno transportador catalítico, mais fluxo; um sumidouro concorrente excessivo, menos. A química torna plausível uma mudança de direção, embora não garanta nada sobre o ponto em que qualquer parâmetro específico atingirá o pico.

Há provas independentes desta dependência da concentração em células que nem sequer têm mitocôndrias. Nas experiências de 1976 com eritrócitos, uma concentração baixa de 1 micromolar estimulou a via das pentoses-fosfato por uma rota fortemente dependente da oxi-hemoglobina, enquanto uma concentração cem vezes superior, de 0.1 milimolar, praticamente não dependia da presença de oxi-hemoglobina e gerava peróxido de hidrogénio nos três ensaios utilizados. O mesmo corante, dois mecanismos, separados pela concentração. Os glóbulos vermelhos não respiram, pelo que esta não é uma curva mitocondrial, mas mostra que a química redox do corante muda de caráter à medida que a concentração aumenta, exatamente o que a explicação mitocondrial exige.

Quatro curvas, quatro configurações

A figura abaixo volta a desenhar os quatro conjuntos de dados lado a lado. Cada painel mantém os seus próprios eixos e condições, porque sobrepô-los numa única escala seria a primeira falsidade que este artigo poderia apresentar. O desenho é esquemático; os valores e condições exatos encontram-se no texto.

Painel A: citocromo oxidase em homogenato de cérebro de rato. A curva mitocondrial mais nítida surge de forma indireta, representada na revisão a partir de dados de homogenato de cérebro de rato: cerca de 138 por cento da atividade de controlo a 0.5 micromolar, regresso ao controlo perto de 5 micromolar e descida abaixo da linha de base perto de 10 micromolar, ponto em que os autores sugerem que o corante está a retirar eletrões dos complexos normais da cadeia. Homogenato, micromolar, ensaio espectrofotométrico. Essa frase contém todo o contexto, e a curva nada significa fora dele.

Painel B: memória de ratos e corrida na roda. No estudo de memória em ratos, foram testadas injeções únicas pós-treino 24 horas mais tarde. Doses de 1 a 10 miligramas por quilograma deixaram a locomoção e a alimentação indistinguíveis das observadas com solução salina, enquanto 50 a 100 miligramas por quilograma reduziram acentuadamente a corrida na roda (mediana de 35 contra 279 rotações), e a dose mais elevada provocou piloereção, movimentos descoordenados e uma morte. A dose de 4 miligramas por quilograma melhorou a habituação e o reconhecimento de objetos: os ratos tratados passaram quase mais 10 segundos junto do objeto novo. O consumo de oxigénio cerebral aumentou tanto em homogenato exposto a uma concentração micromolar baixa do corante reduzido como em cérebros recolhidos 24 horas após 1 miligrama por quilograma in vivo. Note a separação: o comportamento utilizou doses sistémicas pós-treino, o consumo de oxigénio utilizou concentrações em homogenato mais uma dose in vivo, e são duas experiências, não uma única curva.

Painel C: labirinto em T de peixes-zebra. O estudo com peixes-zebra manteve peixes treinados imersos durante 12 horas após o treino em concentrações nominais no banho de 0.1, 0.5, 5.0 ou 10.0 micromolar, usando como controlo um corante alimentar azul. O grupo de 0.5 micromolar teve o melhor desempenho, o grupo de 5.0 igualou o controlo e o grupo de 10.0 teve um desempenho pior do que os grupos de dose mais baixa. O painel exige duas precauções. Micromolar no banho não equivale a micromolar no sangue ou no cérebro; entre a água do aquário e o tecido existem distribuição e acumulação. E a estatística é mais fraca do que a forma da curva sugere: a dose alta diferiu dos grupos de dose mais baixa, sem terem sido comunicadas outras diferenças significativas entre grupos. A curva é real, mas aproximada.

Painel D: a via metabólica dos eritrócitos. Metz e colegas compararam 1 micromolar com 0.1 milimolar em glóbulos vermelhos humanos sob ar, monóxido de carbono e uma mistura que produzia carboxi-hemoglobina quase total a uma pressão fisiológica de oxigénio. A estimulação a dose baixa colapsou sem oxi-hemoglobina; a estimulação a dose alta quase não foi afetada. O peróxido apareceu apenas na dose alta. Este painel deve estar ao lado dos restantes enquanto exemplo de química, não como um quarto ponto numa suposta curva universal: sem mitocôndrias, uma diferença de concentração de cem vezes e misturas gasosas manipuladas.

Porque os picos não coincidem, nem devem coincidir

Os quatro picos situam-se em 0.5 micromolar num homogenato, 4 miligramas por quilograma injetados após o treino, 0.5 micromolar na água do aquário e um par baixo-versus-alto separado por um fator de cem nos glóbulos vermelhos. Tratar dois destes valores como se fossem o mesmo número é um erro de categoria. Cada parâmetro tem a sua própria curva: o ponto ótimo para a memória não tem de coincidir com o ponto ótimo para a atividade da oxidase, consumo de oxigénio, locomoção ou produção de peróxido. Cada unidade de concentração significa algo diferente: micromolar no homogenato, micromolar nominal no banho, miligramas sistémicos por quilograma, concentrações no plasma, cérebro e mitocôndrias são grandezas diferentes, e a tendência do azul de metileno para se acumular nas mitocôndrias e no cérebro mantém-nas distintas. Cada modelo acrescenta a sua própria farmacocinética: espécie, via e momento de administração determinam que tecido entra em contacto com que quantidade de corante e durante quanto tempo.

É também aqui que importa o papel da dose e da via na segurança do azul de metileno, uma vez que os efeitos de dose elevada observados nestes artigos — supressão motora, movimentos descoordenados, um rato morto, produção de peróxido — são sinais de toxicidade nas respetivas configurações experimentais, não margens de segurança para outras situações. E quem se sentir tentado a converter 4 miligramas por quilograma num rato num regime humano deve primeiro compreender como os resultados em animais se relacionam com a evidência em humanos: uma conversão simples de miligramas por quilograma entre espécies é inadequada.

O erro a evitar

O U invertido é sedutor porque parece um seletor de dose com um ponto ideal assinalado. Não é. A hormese descreve o que aconteceu a um parâmetro numa determinada configuração experimental. Junte quatro descrições desse tipo e obtém quatro picos em quatro sistemas de unidades, precisamente o contrário de um seletor. A utilização correta destas curvas é comparativa e cautelar: espere que os efeitos se invertam com a concentração, espere que cada parâmetro se inverta no seu próprio ponto e desconfie de qualquer afirmação que use o pico de uma experiência para justificar uma dose noutra espécie, via, tecido ou finalidade. A distinção entre padrões experimentais e decisões pessoais de dosagem é o ponto central de todo este artigo, repetido aqui para que não passe despercebido.

Como ler o próximo artigo sobre dose-resposta

Quatro perguntas aplicam-se a quase todas as curvas de azul de metileno que encontrará. Que parâmetro está no eixo vertical, e a sua inversão desenharia um U ou um J. Que concentração é realmente indicada pelo eixo horizontal: banho nominal, homogenato, plasma, cérebro estimado ou dose sistémica administrada. Que modelo e cronologia a produziram: homogenato, cultura celular com as luzes acesas ou apagadas, animais treinados que receberam a dose antes ou depois do treino, testados em que momento. E qual foi o controlo: solução salina, corante alimentar azul, veículo, e se a estatística do artigo sustenta cada comparação entre pares ou apenas a forma geral. Um artigo que responda às quatro perguntas merece atenção. Um artigo que apresente um pico sem elas deu-lhe um número sem morada.