Azul de metileno e Bartonella: resultados laboratoriais e limites da evidência clínica

Uma placa de cultura e um doente partilham uma palavra, infeção, mas não um conceito. Na placa, a infeção é uma contagem de colónias em ágar. No doente, envolve bactérias dentro de células e vasos, fármacos a circular pelo sangue e pelos tecidos e um sistema imunitário a fazer parte do trabalho. Confundir os dois faz com que um número laboratorial impressionante comece a parecer um tratamento. Mantê-los separados faz com que o mesmo número seja aquilo que é: uma razão para realizar a experiência seguinte.

Essa distinção é o objetivo central desta revisão sobre azul de metileno e Bartonella. Dois estudos laboratoriais do mesmo grupo de investigação testaram o azul de metileno contra Bartonella henselae em estados sem crescimento. Ambos comunicaram forte atividade em vidro e plástico. Nenhum testou uma pessoa.

Porque é que os investigadores testam a fase estacionária

A maioria dos testes de antibióticos utiliza células em crescimento. Esse modelo não abrange um caso mais difícil: células que deixaram de se dividir e toleram fármacos que eliminam as suas congéneres em crescimento.

Bartonella pode persistir no organismo, incluindo no interior de eritrócitos e células endoteliais. Por isso, o grupo perguntou quais os fármacos aprovados capazes de eliminar B. henselae depois de esta entrar em fase estacionária. Uma MIC baixa contra células em crescimento não previu a eliminação em fase estacionária. A rifampicina tinha uma MIC muito baixa, mas eliminava mal as células estacionárias, enquanto compostos com valores de MIC mais elevados as eliminavam bem. Os leitores que pretendam um método geral para este tipo de artigo podem encontrá-lo no guia para a leitura de investigação sobre azul de metileno.

Primeiro rastreio: Li e colegas, 2019

O rastreio de fase estacionária de 2019 em Antibiotics utilizou uma única estirpe, B. henselae JK53, cultivada em meio Schneider com 10 percent de soro fetal bovino a 37 C com 5 percent CO2. As culturas com um dia eram maioritariamente constituídas por células em divisão dispersas. As culturas com cinco dias, com cerca de 10 to the 8th unidades formadoras de colónias por mL, foram consideradas em fase estacionária e continham agregados visíveis.

O ensaio utilizou SYBR Green I com iodeto de propídio, calibrado com misturas de células vivas e células mortas com isopropanol. Como o azul de metileno tem uma cor intensa, os resultados positivos foram confirmados por microscopia e depois por contagens de colónias em ágar de sangue, o critério de avaliação mais rigoroso.

Entre 1,581 fármacos aprovados a 50 micromolar, o azul de metileno deixou 16 percent de viabilidade segundo o leitor de placas e 25 percent segundo a microscopia. A daptomicina registou 21 percent, vários azóis registaram 22 a 27 percent, a gentamicina 32 percent, a eritromicina 66 percent e a ciprofloxacina 74 percent. O pamoato de pirvínio pareceu mais potente no leitor, mas não pôde ser avaliado por microscopia devido à sua própria fluorescência.

Contra B. henselae em crescimento, a MIC do azul de metileno foi de 0.08 a 0.16 micrograms per mL. Contra células estacionárias com cinco dias, a 5 micrograms per mL, a contagem de colónias desceu até não serem detetadas colónias após um dia de exposição, igualando a daptomicina e o pamoato de pirvínio nas concentrações testadas. Um ensaio separado de tempo de eliminação utilizou 10 micrograms per mL. Estes são níveis de exposição laboratorial, não doses, e o artigo apresenta-os como tal. Um valor máximo plasmático em humanos citado, próximo de 3.9 micrograms per mL, surge no artigo apenas como contexto de fundo. A visão geral da farmacocinética do azul de metileno explica porque é que um valor plasmático não pode ser interpretado como um valor tecidular.

Duas limitações são explicitamente indicadas no artigo. Não houve modelo de biofilme nem testes de combinações com azul de metileno. Os agregados com cinco dias eram aglomerados numa cultura líquida em fase estacionária, não uma experiência validada de biofilme. Os autores defenderam a realização de estudos em animais, estudos de combinações, estudos de biofilmes e testes noutras espécies de Bartonella.

Combinações e células derivadas de biofilme: Zheng e colegas, 2020

O seguimento de 2020 em BMC Microbiology manteve a mesma estirpe e o mesmo meio, mas passou para culturas estacionárias com seis dias e acrescentou dois elementos que faltavam no primeiro artigo: combinações de dois fármacos e um modelo de células derivadas de biofilme.

Para fármacos isolados, todos a 5 micrograms per mL durante 24 horas, o azul de metileno deixou 3.2 times 10 to the 4th unidades formadoras de colónias por mL, face a um controlo próximo de 2.8 times 10 to the 10th. A ciprofloxacina, a gentamicina e a nitrofurantoína deixaram menos colónias no mesmo ponto. Este resultado difere do de 2019, em que o mesmo nível nominal não produziu colónias detetáveis após um dia. A idade da cultura, a densidade e o manuseamento diferiram, pelo que a eliminação foi reprodutível quanto à direção, mas não idêntica quanto à magnitude. Esta variação entre ensaios é uma das razões pelas quais as verificações padrão de segurança e interações tratam a potência laboratorial separadamente do efeito clínico.

O rastreio de combinações é a parte mais citada. Cada componente foi fixado em 5 micrograms per mL. Tanto azitromicina mais azul de metileno como rifampicina mais azul de metileno não produziram colónias detetáveis em fase estacionária às 24 horas, tal como os dois pares com ciprofloxacina, sendo estes os únicos quatro entre 25 pares testados. Não foi realizada uma análise formal de sinergia, pelo que o termo correto é combinação ativa nestas condições, e não sinergia comprovada.

A experiência de biofilme testou células recuperadas de um biofilme jovem desagregado, e não a penetração num biofilme maduro intacto. As culturas foram mantidas durante cinco dias, diluídas em placas de poços durante mais cinco dias, confirmadas por coloração com violeta de cristal e depois raspadas antes da exposição aos fármacos. A 5 micrograms per mL, o azul de metileno isolado desceu para 2.3 times 10 to the 2nd ao dia 6, ficando entre os melhores agentes isolados, mas sem chegar a zero. Ambas as combinações com azul de metileno chegaram a zero ao dia 6, tal como ambas as combinações com ciprofloxacina.

Os autores assinalaram as mesmas limitações que um leitor cuidadoso identificaria: biofilme jovem raspado em vez de biofilme antigo intacto, uma única concentração conveniente para todos os fármacos em vez de cada fármaco no seu próprio pico realista, apenas pares selecionados centrados na azitromicina ou rifampicina, uma única estirpe, ausência de animais e ausência de doentes. Foi proposto trabalho posterior com três fármacos, mas não foram apresentados resultados.

Comparação do desenho dos estudos

A tabela resume o objetivo deste artigo. Tudo o que está à esquerda da última coluna corresponde a trabalho em cultura. Nada em qualquer dos artigos ocupa a última coluna.

Bartonella não é Borrelia

Ambos os artigos mencionam Borrelia burgdorferi, a espiroqueta da doença de Lyme, porque o ensaio com corante teve origem em trabalhos anteriores sobre Borrelia em fase estacionária realizados no mesmo laboratório, nos quais o azul de metileno e a daptomicina também tinham surgido como resultados positivos. Esse historial é um contexto útil e uma fonte frequente de erro.

Nenhuma experiência em qualquer dos artigos sobre Bartonella testa Borrelia lado a lado com Bartonella. Os organismos diferem, os meios diferem, as concentrações diferem, e o efeito hipotético do azul de metileno sobre a membrana de Bartonella foi apresentado como uma especulação que exige mais estudo. Os resultados não devem ser transferidos entre espécies, e nenhum dos artigos sustenta afirmações abrangentes sobre parasitas. A comparação entre persistentes de Borrelia e Bartonella mantém as duas literaturas separadas por esta razão.

Porque é que as culturas não se transformam num protocolo

O interesse de pesquisa por um protocolo de azul de metileno para Bartonella é compreensível. Estes artigos são precisamente a razão pela qual essa expressão deve ser tratada como um sinal de alerta e não como uma lista de compras.

Primeiro, 5 micrograms per mL num poço não é uma prescrição. Não inclui absorção, distribuição, ligação às proteínas, penetração intracelular nem tolerabilidade. Os autores escolheram esse valor como uma média aproximada dos picos de antibióticos e afirmaram que trabalhos futuros deveriam utilizar cada fármaco no seu próprio nível realista.

Segundo, zero colónias significa ausência de colónias nessas condições de plaqueamento, não tecido estéril. Persistentes, bactérias intracelulares e limitações da amostragem ficam todos fora da placa de ágar.

Terceiro, combinações que esterilizam um poço podem falhar ou causar danos num organismo. Azitromicina mais azul de metileno e rifampicina mais azul de metileno são pares laboratoriais em níveis de exposição laboratoriais. Sem farmacocinética em animais e dados controlados em humanos, não existe dose, duração nem relação benefício-risco estabelecida. Qualquer pessoa que esteja a ponderar opções deve discuti-las com um profissional de saúde e rever quando a utilização de azul de metileno requer supervisão médica antes de tirar qualquer conclusão a partir de dados obtidos em placas de cultura.

A conclusão limitada que estes artigos sustentam é a seguinte: o azul de metileno apresenta atividade reprodutível in vitro contra B. henselae JK53 sem crescimento, incluindo em combinações laboratoriais de dois fármacos, com os resultados mais fortes em combinações e células derivadas de biofilme provenientes do estudo de 2020. Tudo o resto, incluindo se essa atividade é relevante para a bartonelose humana, permanece por testar.