Ágar EMB versus ágar MacConkey: seleção e interpretação dos meios

Um estudante inocula por estriamento a mesma amostra de água em duas placas. Numa delas, aparecem colónias escuras com um brilho metálico verde. Na outra, aparecem colónias cor-de-rosa vivo com um halo turvo. Ambas as placas foram inoculadas a partir do mesmo tubo, incubadas lado a lado e lidas à mesma hora. O estudante pergunta qual das placas está certa.

Ambas estão certas. Respondem a perguntas diferentes. A confusão surge quando os dois meios são tratados como métodos de rastreio intercambiáveis para bactérias intestinais. Partilham uma finalidade, que é selecionar organismos entéricos Gram-negativos e separar fermentadores de lactose de não fermentadores, mas concretizam essa finalidade com químicas diferentes e lógicas visuais diferentes. Depois de compreender os dois conceitos subjacentes, a seleção das placas e a leitura das colónias tornam-se rotineiras.

A resposta curta

O ágar EMB utiliza dois corantes, eosina Y e azul de metileno, que desempenham duas funções: suprimem o crescimento de Gram-positivos e precipitam em redor de produtores intensos de ácido para criar colónias escuras, classicamente com um brilho metálico verde no caso de Escherichia coli. O ágar MacConkey separa as funções: os sais biliares e o violeta de cristal suprimem os Gram-positivos, a lactose alimenta a fermentação e o vermelho neutro assinala a presença de ácido através de colónias cor-de-rosa ou vermelhas. Se o objetivo for uma demonstração presuntiva visualmente marcante de E. coli, o EMB tem o seu lugar. Se o objetivo for uma distinção clara entre fermentadores de lactose cor-de-rosa e não fermentadores incolores, sobretudo em fluxos de trabalho com fezes ou urina, o MacConkey é normalmente mais simples de interpretar. Nenhuma das placas identifica um organismo apenas pela cor.

EMB: corantes que selecionam e indicam ao mesmo tempo

O conceito do EMB combina seleção e indicação nas mesmas moléculas. O protocolo da ASM para ágar de eosina e azul de metileno descreve o EMB como simultaneamente seletivo e diferencial, em que o par de corantes inibe muitos organismos Gram-positivos, enquanto a fermentação da lactose promove a captação e precipitação dos corantes. Uma formulação padrão de Levine contém peptona, lactose, fosfato, eosina Y, azul de metileno e ágar, conforme indicado no método BAM da FDA para ágar EMB de Levine. Tenha em conta que algumas fórmulas EMB mais antigas adicionavam sacarose juntamente com lactose, enquanto o EMB de Levine contém lactose sem sacarose; por isso, registe qual a formulação utilizada pelo seu laboratório.

Interpretar o EMB significa interpretar o comportamento dos corantes. Uma fermentação vigorosa da lactose produz ácido suficiente para provocar uma forte precipitação dos corantes, conferindo a E. coli centros azul-escuros a pretos e, no caso clássico, um brilho metálico verde sob luz refletida. Fermentadores mais fracos, como Enterobacter e Klebsiella, crescem tipicamente como colónias mucóides cor-de-rosa a púrpura, sem esse brilho. Não fermentadores como Salmonella, Shigella e Proteus crescem geralmente como colónias incolores ou translúcidas, porque não produzem a libertação intensa de ácido que precipita os corantes. Os Gram-positivos são normalmente suprimidos, embora o grau de supressão varie consoante a estirpe e o produto. A química detalhada da preparação dos corantes, incluindo a razão pela qual o azul de metileno se comporta inicialmente como um corante catiónico, pertence a uma discussão separada sobre formulações de corantes, e o contexto geral de microscopia encontra-se num atlas de métodos de coloração. Este artigo centra-se na seleção e leitura das placas.

A figura acima é ilustrativa. Mostra a lógica visual esperada: colónias escuras com brilho, tipos mucóides cor-de-rosa e tipos pálidos no EMB, em comparação com tipos cor-de-rosa versus pálidos no MacConkey. Utilize-a para aprender o padrão e, depois, confirme cada interpretação com controlos fotografados e com o folheto do produto correspondente ao meio exato utilizado na bancada.

MacConkey: funções separadas, regra visual mais simples

O conceito do MacConkey atribui cada função a um ingrediente separado. O protocolo da ASM para ágar MacConkey apresenta o mesmo enquadramento seletivo e diferencial, e o método BAM da FDA para ágar MacConkey enumera os componentes funcionais: peptonas, lactose, sais biliares, sal, vermelho neutro, violeta de cristal e ágar. Os sais biliares e o violeta de cristal selecionam contra Gram-positivos. A lactose fornece o substrato para fermentação. O vermelho neutro atua como indicador de pH, tornando-se cor-de-rosa a vermelho onde se forma ácido, por vezes com precipitação de bílis em redor de fermentadores intensos.

A regra de leitura é deliberadamente simples: cor-de-rosa significa fermentador de lactose; incolor ou pálido significa não fermentador. E. coli apresenta-se cor-de-rosa a vermelha, frequentemente com um halo de precipitado biliar. Klebsiella e Enterobacter apresentam-se cor-de-rosa e frequentemente mucóides devido às suas cápsulas. Salmonella, Shigella, Proteus e muitos outros bacilos Gram-negativos apresentam-se incolores. Existe ainda uma vantagem relevante em laboratórios de ensino: os sais biliares reduzem geralmente o fenómeno de swarming de Proteus, facilitando a obtenção de colónias isoladas em MacConkey em comparação com meios não seletivos, embora a supressão não seja absoluta e existam alternativas sem sal quando o controlo do swarming é a prioridade.

A razão molecular pela qual os corantes se comportam desta forma está relacionada com a carga e a estrutura. O azul de metileno é um corante catiónico de fenotiazina cuja estrutura e propriedades explicam a sua afinidade pelas superfícies bacterianas ácidas, a mesma afinidade que atua quando precipita em zonas ácidas no EMB.

Comparação rápida

Leia a tabela como um procedimento de decisão. Quando o exercício exige que os estudantes observem um gradiente da intensidade da fermentação com um ponto final visualmente marcante, o EMB mostra-o. Quando o exercício exige uma separação binária rápida antes da confirmação bioquímica, o MacConkey mostra-a.

Que meio utilizar para cada amostra

Para exercícios com água destinados ao reconhecimento presuntivo de coliformes fecais ou E. coli, o EMB é atrativo porque o brilho é visualmente distintivo. O MacConkey também permite trabalhar com Gram-negativos entéricos e tem utilização histórica em análises de água, mas nenhuma das placas substitui um método regulamentar para água, que pode especificar meios como mTEC modificado ou MI consoante o ensaio. Consulte o método que o seu laboratório é obrigado a seguir.

Para separações do tipo realizado em amostras de fezes entre fermentadores e não fermentadores, o MacConkey é geralmente o mais útil dos dois. Na prática, o trabalho com fezes para Salmonella ou Shigella utiliza normalmente meios entéricos mais seletivos, como XLD ou Hektoen enteric, em vez de depender apenas de MacConkey.

Para ensino com amostras de urina que simule um fluxo de trabalho clínico, combine MacConkey com ágar sangue. O MacConkey fornece a separação inicial dos Gram-negativos, enquanto o ágar sangue permite recuperar organismos que o MacConkey suprime. Esta combinação é padrão em descrições clínicas da preparação de culturas de urina.

Para ensinar apenas os conceitos, utilize ambos. O EMB ensina que a intensidade da fermentação é importante e que uma molécula pode desempenhar duas funções. O MacConkey ensina um desenho modular: seletor, substrato e indicador mantidos separados. Os estudantes que inoculam lado a lado uma E. coli conhecida, uma Klebsiella aerogenes conhecida e uma Salmonella conhecida em ambos os meios raramente voltam a confundir as duas lógicas.

Armadilhas de leitura que se repetem todos os períodos letivos

O erro mais comum é identificar apenas pela cor. Uma colónia cor-de-rosa em MacConkey pode ser E. coli, Klebsiella, Enterobacter ou outro fermentador. Uma colónia incolor pode ser Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas ou outro não fermentador. A cor é um fenótipo de rastreio que orienta o trabalho de confirmação, como coloração de Gram, oxidase, painéis bioquímicos ou identificação instrumental; não é o nome de uma espécie.

O segundo erro é atribuir demasiada importância à ausência de brilho. Algumas colónias genuínas de E. coli, sobretudo as isoladas, produzem pouco ou nenhum brilho metálico em EMB. A ausência de brilho não exclui E. coli e a presença de brilho não a comprova. Trate o brilho como um indício presuntivo.

O terceiro erro é comparar placas com idades diferentes. Fermentadores tardios de lactose podem tornar-se cor-de-rosa em MacConkey após incubação prolongada, o que esbate a separação nítida entre fermentadores e não fermentadores. Faça a leitura à hora especificada pelo laboratório e registe o tempo de incubação juntamente com o resultado.

O quarto erro é interpretar um crescimento misto como um único organismo. Uma colónia cor-de-rosa junto de uma colónia incolor representa dois fenótipos, não um estado intermédio. Selecione colónias bem isoladas e trabalhe cada morfotipo separadamente. A textura mucóide cria uma armadilha semelhante: tanto Klebsiella como Enterobacter podem apresentar aspeto mucóide, pelo que a cápsula, por si só, nunca determina o nome. O organismo anteriormente ensinado como Enterobacter aerogenes é agora classificado como Klebsiella aerogenes, o que explica por que razão tabelas antigas e designações mais recentes parecem discordar.

Controlos e uma regra final

Utilize controlos fotografados ou frescos em cada sessão: E. coli para a reação de fermentador forte, Klebsiella aerogenes para fermentação mucóide sem o brilho clássico, uma estirpe de Salmonella para a reação incolor de não fermentador e Staphylococcus aureus para confirmar a supressão de Gram-positivos no produto exato utilizado. Faça corresponder os números das estirpes e os critérios de aceitação ao folheto do fabricante, porque a seletividade varia com o teor de bílis, violeta de cristal e corantes.

Recorde uma frase na bancada. O EMB utiliza corantes que simultaneamente selecionam e indicam, proporcionando um sinal marcante de E. coli à custa de uma leitura mais subtil. O MacConkey separa a seleção da indicação, proporcionando uma distinção simples entre cor-de-rosa e pálido à custa de menos detalhe sobre a fermentação. Escolha o meio cujo conceito corresponde à pergunta, confirme a cor com testes adequados e as duas placas deixam de competir e passam a complementar-se.