Artykuł
Test redukcji błękitu metylenowego w mleku: zasada i ograniczenia
Studentka podnosi dwie probówki z mlekiem. Zawartość jednej stała się biała w ciągu godziny. Zawartość drugiej pozostała niebieska przez pięć godzin. Studentka wskazuje niebieską probówkę i mówi, że to mleko można bezpiecznie wypić.
Ten wniosek ujawnia błędne rozumienie testu. Test mleka z błękitem metylenowym nie określa jego bezpieczeństwa. Pokazuje, jak szybko populacja drobnoustrojów w danej probówce obniża potencjał redoks w ustalonych warunkach. Powolna redukcja oznacza niską ogólną aktywność metaboliczną w próbce. Nie mówi nic o tym, jakie organizmy są obecne, czy znajduje się wśród nich patogen ani czy mleko zostało prawidłowo spasteryzowane.
To rozróżnienie jest ważne, ponieważ test wygląda przekonująco. Niebieska barwa znika. Zegar podaje liczbę. Liczby sprzyjają nadinterpretacji. Ten artykuł wyjaśnia użyteczną interpretację i wskazuje, dlaczego ta niebezpieczna jest błędna.
Co właściwie mierzy redukcja
Błękit metylenowy jest niebieski w postaci utlenionej i niemal bezbarwny po redukcji do leukobłękitu metylenowego. Świeże mleko zawiera rozpuszczony tlen, który utrzymuje niebieską barwę barwnika. Bakterie prowadzące oddychanie i fermentację zużywają ten tlen oraz uwalniają związki redukujące. Gdy potencjał redoks spadnie dostatecznie nisko, barwnik przyjmuje elektrony i traci barwę. Podręcznik mikrobiologii mleczarskiej Uniwersytetu w Guelph opisuje tę samą sekwencję jako usuwanie tlenu, po którym następuje powstawanie substancji redukujących podczas metabolizmu bakterii.
Klasyczne badania opublikowane w Journal of Dairy Science przedstawiają to jako proces dwuetapowy: najpierw mikroflora wyczerpuje tlen, a następnie składniki mleka szybko redukują barwnik. Test redukcji błękitu metylenowego w mleku najlepiej więc rozumieć jako funkcjonalne oznaczenie łącznej aktywności metabolicznej, a nie metodę liczenia komórek. Właściwości redoks błękitu metylenowego wyjaśniają chemię tej zmiany.
Tlen odwraca zmianę obserwowaną w punkcie końcowym. Zredukowana forma leuko barwnika po kontakcie z powietrzem ponownie się utlenia i staje się niebieska. Dlatego wstrząsanie, przelewanie, szerokie probówki i duża przestrzeń nad cieczą opóźniają uzyskanie wyniku. Na powierzchni stykającej się z powietrzem często pozostaje cienki niebieski pierścień, nawet gdy reszta zawartości probówki jest już odbarwiona. Standardowe procedury dopuszczają obecność tego pierścienia, zamiast wymagać czekania na jego zanik.
Rodzaj organizmów wprowadza kolejne zniekształcenie. Bakterie z grupy coli i wiele bakterii mlekowych szybko redukują barwnik. Wiele drobnoustrojów psychrotrofowych i ciepłoopornych redukuje go powoli albo prawie wcale. Dwie próbki mleka z taką samą liczbą bakterii oznaczoną metodą płytkową mogą tracić niebieską barwę w odstępie kilku godzin. Już sam ten fakt wyklucza przeliczanie czasu na liczbę kolonii.
Kontrolowana procedura laboratoryjna
Wersje terenowe i podręcznikowe różnią się szczegółami, dlatego wynik jest ważny wyłącznie w ramach metody, którą go uzyskano. Typowa wersja stosowana w laboratorium żywności przebiega następująco:
- Pobierz surowe mleko przy minimalnym napowietrzaniu i niezwłocznie je schłodź. Przed pobraniem próbki wymieszaj je przez delikatne odwracanie pojemnika.
- Wprowadź 10 mL mleka do sterylnej probówki z 1 mL roztworu roboczego barwnika. Jedno z powszechnie stosowanych stężeń roboczych wynosi 0.005 procent barwnika, przy stosunku mleka do roztworu barwnika 10 do 1.
- Zamknij probówkę korkiem, delikatnie odwróć ją dwukrotnie i w ciągu kilku minut umieść w łaźni wodnej. Typowa temperatura inkubacji wynosi od 35 do 38 stopni Celsjusza, zależnie od stosowanej normy. Zapisz, którą normę stosujesz.
- Podczas inkubacji chroń probówki przed światłem, ponieważ światło przyspiesza redukcję.
- Wykonaj odczyt po 30 minutach, a następnie w stałych odstępach czasu. Punkt końcowy to moment, w którym zawartość probówki odpowiada wzorcowi z przegotowanego mleka lub osiąga stopień odbarwienia określony w procedurze.
- Zachowaj probówkę z tym samym mlekiem bez dodatku barwnika jako kontrolę wizualną, jeśli wymaga tego metoda.
Podręcznik badania mleka FAO podaje szczegółową terenową wersję tej sekwencji: 10 mL mleka i 1 mL barwnika, zamknięcie korkiem, delikatne odwracanie, inkubacja w temperaturze około 37 do 38 stopni oraz odczyty co 30 minut. W probówkach kontrolnych stosuje się przegotowane mleko, aby zniszczyć naturalny układ redukujący i uzyskać punkt odniesienia do porównania barwy.
Powyższy schemat wyznacza warunki, które trzeba kontrolować. Te same objętości, ten sam barwnik, ta sama temperatura, to samo mieszanie, ta sama ochrona przed światłem i ta sama reguła wyznaczania punktu końcowego. Zmiana dowolnego z tych parametrów zmienia również czas. Dlatego domowych wersji z dowolnie dobranym stężeniem barwnika nie można porównywać z laboratoryjnymi klasami jakości.
Co oznacza czas redukcji
Dłuższy czas oznacza niższą ogólną aktywność w podanych warunkach. Krótszy czas oznacza wyższą ogólną aktywność. Tabele dydaktyczne z zakresu mleczarstwa przypisują tym czasom przybliżone klasy jakości, na przykład w jednym ze schematów opartych na BIS 5 lub więcej godzin oznacza jakość bardzo dobrą, a czas poniżej 30 minut — niską.
Najważniejszy wniosek wynika z różnic między schematami. Wynik 5 godzin nie ma uniwersalnej klasy jakości. Należy do procedury, która go zdefiniowała. Uzasadniony format raportowania jest zatem następujący:
MBRT wynosi X godzin według wskazanej metody, co odpowiada klasie jakości określonej w tej metodzie.
Nigdy nie oznacza to, że MBRT wynosi X jednostek tworzących kolonie na mL. Wytyczne oparte na Standard Methods wskazują, że wyników redukcji barwnika nie należy podawać jako liczby bakterii. Procedura barwienia prostego błękitem metylenowym również odpowiada na inne pytanie, ponieważ pokazuje kształt komórek pod mikroskopem, a nie ogólną aktywność w probówce.
Tabela interpretacji i ograniczeń
Ta tabela stanowi autorskie zestawienie referencyjne dla artykułu. Czytaj każdy wiersz w całości. Żadna pojedyncza komórka tabeli nie powinna być rozpatrywana osobno.
| Obserwacja lub twierdzenie | Na co wskazuje | Czego nie może dowieść | Główne czynniki zakłócające |
|---|---|---|---|
| Szybki zanik niebieskiej barwy, poniżej 2 godzin w jednym ze schematów dla surowego mleka | Wysoka aktywność redukująca, zgodna z dużym obciążeniem drobnoustrojami lub małą trwałością mleka | Gatunku, dokładnej liczby drobnoustrojów, obecności toksyn ani nieprawidłowej pasteryzacji | Przechowywanie w cieple, mikroflora bogata w bakterie z grupy coli, światło, mała ilość barwnika |
| Czas pośredni, od 2 do 4 godzin | Umiarkowana aktywność; klasa jakości wyłącznie w ramach wskazanego schematu | Bezpieczeństwa ani braku drobnoustrojów wolno redukujących barwnik | Wysoka temperatura inkubacji, różnice w napowietrzaniu, oddzielanie się tłuszczu |
| Powolna redukcja, 5 lub więcej godzin | Niska ogólna aktywność w danym schemacie | Braku patogenów, przeprowadzenia pasteryzacji ani bezpieczeństwa chemicznego | Pozostałości antybiotyków, konserwanty, dodatkowy rozpuszczony tlen, duża ilość barwnika |
| Niebieski pierścień pozostaje na powierzchni, podczas gdy reszta zawartości się odbarwia | Ponowne utlenianie na granicy z powietrzem, normalny efekt brzegowy | Nieudanego testu ani niepełnej reakcji | Szeroka probówka, luźny korek, wielokrotne otwieranie w celu sprawdzenia |
| Biała zawartość probówki po inkubacji mleka poddanego ogrzewaniu | Zmieniony układ redukujący oraz zachowana aktywność drobnoustrojów | Tego, że ogrzewanie odpowiadało zwalidowanej pasteryzacji | Uszkodzenia termiczne drobnoustrojów, ich regeneracja podczas inkubacji, późniejsze zanieczyszczenie |
| Dowolna pojedyncza wartość MBRT podana bez wskazania metody | Nieznane warunki testu | Jakiejkolwiek klasy jakości ani liczby drobnoustrojów | Niepodany skład roztworu barwnika, stosunek objętości, temperatura, sposób mieszania i reguła wyznaczania punktu końcowego |
Badania oparte na wzroście, takie jak hodowla bakterii na podłożach, pozostają sposobem oznaczania liczby drobnoustrojów i ich izolacji. Probówka z testem redukcji służy do badania przesiewowego. Płytka umożliwia identyfikację i zliczanie.
Czego test nie może dowieść w kwestii bezpieczeństwa
Powolna redukcja nie dowodzi braku patogenów. Patogen obecny w ilości istotnej klinicznie może mieć niewielki udział w ogólnym zużyciu tlenu. Wykrywanie patogenów wymaga metod swoistych dla danego organizmu, które aktualne Standard Methods traktuje jako obszar odrębny od ogólnych badań przesiewowych jakości.
Test nie może potwierdzić pasteryzacji. Weryfikacja obróbki cieplnej wymaga badania aktywności fosfatazy alkalicznej lub innej zwalidowanej metody zgodnej z wytycznymi Codex dotyczącymi higieny produktów mlecznych. Biała lub niebieska zawartość probówki nie mówi nic o historii czasu i temperatury obróbki danej partii.
Test nie może potwierdzić bezpieczeństwa żywności. Bezpieczeństwo zależy od patogenów, wcześniej wytworzonych toksyn, pozostałości leków, zanieczyszczeń chemicznych, historii łańcucha chłodniczego oraz zanieczyszczenia po pobraniu próbki. Codex traktuje bezpieczeństwo produktów mlecznych jako wynik ciągu środków kontroli, a nie pojedynczego wyniku badania przesiewowego.
Badanie w laboratorium żywności to nie test domowy
W laboratorium mleczarskim test służy do przesiewowej oceny mleka przy przyjęciu, porównywania dostawców w czasie lub nauczania mikrobiologii redoks pod nadzorem. Pochodzenie próbek można prześledzić. Odczynniki są standaryzowane. Temperatury są rejestrowane. Odpady trafiają do laboratoryjnego systemu utylizacji.
Domowe testowanie nie zapewnia żadnego z tych warunków. Objętości odmierzane w kuchni są przybliżone. Stężenia barwników sprzedawanych online znacznie się różnią. Inkubacja często odbywa się w ciepłym pomieszczeniu zamiast w skalibrowanej łaźni. Zmiana barwy nadal zachodzi, przez co wynik wydaje się wiarygodny, choć brakuje wszystkich kontrolowanych warunków, które nadawały mu znaczenie.
Poważniejsze ryzyko dotyczy zachowania. Niebieska zawartość probówki w domu zachęca do picia surowego mleka, które laboratorium nadal skierowałoby do oznaczenia liczby bakterii metodą płytkową, badań przesiewowych na obecność patogenów i oznaczenia pozostałości. Test mleka z błękitem metylenowym opracowano do klasyfikowania surowego mleka przy przyjęciu, a nie do dopuszczania go do spożycia. Szybsze badanie przesiewowe z rezazuryną ma to samo ograniczenie: szybszy odczyt barwy nadal nie daje odpowiedzi na pytanie o patogeny.
Krótka zasada do pracy przy stole laboratoryjnym
Ustandaryzuj barwnik, stosunek objętości, temperaturę, mieszanie, oświetlenie i punkt końcowy. Podawaj czas wraz z nazwą metody i klasą jakości. Interpretuj minuty z uwzględnieniem historii przechowywania, rodzaju mikroflory, pozostałości i jakości pobrania próbki. Krótki czas sygnalizuje aktywność, którą warto zbadać. Długi czas nigdy nie potwierdza bezpieczeństwa.