Odczytywanie wyglądu kolonii E. coli i innych bakterii na agarze EMB

Student wysiewa nieznany drobnoustrój metodą redukcyjną na agar z eozyną i błękitem metylenowym, inkubuje go przez noc, a po powrocie widzi płytkę z ciemnymi koloniami o zielonym połysku. W notatniku zapisuje „E. coli, potwierdzone”. Ten zapis stwierdza więcej, niż można wywnioskować z płytki. Płytka pokazuje fenotyp wzrostu i fermentacji w określonych warunkach. Identyfikacja gatunku to odrębne stwierdzenie, które wymaga osobnych dowodów.

Ten przewodnik traktuje wyniki na agarze EMB jako zadanie interpretacyjne. Wyjaśnia podstawową zasadę, przedstawia atlas ilustracyjnych płytek z kontrolami i wskazuje sytuacje, w których podręcznikowy obraz bywa mylący.

Zasada działania podłoża

Agar EMB jest podłożem zarówno selektywnym, jak i różnicującym. Barwniki — eozyna Y i błękit metylenowy — hamują wiele drobnoustrojów Gram-dodatnich, dlatego podłoże sprzyja wzrostowi bakterii Gram-ujemnych. Te same barwniki działają jako wskaźniki: gdy drobnoustrój fermentuje dostępny cukier i wytwarza lokalnie dostatecznie dużo kwasu, kolonia silnie wiąże barwniki i przybiera kolor od ciemnofioletowego do granatowoczarnego. Przy intensywnym wytwarzaniu kwasu na powierzchni kolonii może pojawić się metaliczny zielony połysk. Protokół ASM dotyczący płytek z agarem z eozyną i błękitem metylenowym opisuje to połączenie selekcji i różnicowania oraz zawiera fotografie referencyjne do celów dydaktycznych.

Przed odczytaniem wyniku ważny jest jeden szczegół: sprawdź, jaka receptura podłoża jest stosowana. Starsza receptura Holta–Harrisa–Teague’a zawiera laktozę i sacharozę, natomiast EMB Levine’a zawiera tylko laktozę. Drobnoustrój fermentujący sacharozę, ale nie laktozę, taki jak wiele izolatów Serratia marcescens, może wyglądać inaczej na tych dwóch wersjach podłoża. Dokumentacja producenta podłoży EMB wyraźnie wskazuje tę różnicę w recepturach. Zapisz w notatniku producenta i recepturę obok wyniku.

Przygotowany, niezaszczepiony agar EMB ma zwykle barwę od czerwonobrązowej do czerwonofioletowej, czasem z zielonkawym odcieniem lub drobnym osadem. Ta barwa tła nie oznacza wzrostu. Każdy odczyt porównuj z niezaszczepioną płytką lub udokumentowanym wyglądem wyjściowym, a płytkę z posiewem pierwotnym odczytuj po około 18 do 24 godzinach inkubacji tlenowej w temperaturze 35 do 37 C, o ile protokół dydaktyczny nie stanowi inaczej. Wydłużona inkubacja może zmienić wygląd związany z fermentacją.

Jak oglądać płytkę

Używaj dwóch rodzajów oświetlenia. Najpierw obejrzyj płytkę w świetle odbitym lub padającym ukośnie i przechyl ją: metaliczny połysk jest opalizujący i może pojawiać się lub znikać zależnie od kąta obserwacji. Następnie obejrzyj ją w świetle przechodzącym, aby ocenić kolor kolonii i ciemne centra. Oceniaj dobrze odizolowane kolonie, ponieważ zagęszczenie i sąsiednie kolonie zmieniają lokalne nagromadzenie kwasu i mogą osłabiać lub nasilać zabarwienie. Zestaw zdjęć ASM pokazuje to bezpośrednio: E. coli w hodowli mieszanej może utracić oczekiwany połysk, ponieważ otaczające drobnoustroje zmieniają lokalne warunki kwasowe.

Uwzględniaj kontrole, gdy tylko pozwala na to ćwiczenie. Typowy zestaw dydaktyczny obejmuje E. coli ATCC 25922 jako kontrolę fenotypu granatowoczarnego zabarwienia i metalicznego połysku, drobnoustrój niefermentujący, taki jak Salmonella Typhimurium ATCC 14028 lub Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, jako kontrolę fenotypu bezbarwnego oraz drobnoustrój Gram-dodatni, taki jak Enterococcus faecalis lub Staphylococcus aureus, jako kontrolę hamowania, zgodnie ze standardowymi tabelami kontroli jakości podłoży EMB. Jeśli kontrola dodatnia nie wykazuje połysku, najpierw podejrzewaj warunki inkubacji, zagęszczenie kolonii lub recepturę, a dopiero potem właściwości nieznanego drobnoustroju.

Atlas ilustracyjnych płytek

Poniższe płytki są wygenerowanymi ilustracjami, a nie fotografiami rzeczywistych hodowli. Pokazują wzorzec, którego należy szukać, a nie dokładny odcień konkretnego szczepu. Porównuj je z fotografiami referencyjnymi ASM oraz z rzeczywistymi płytkami z laboratorium dydaktycznego.

Płytka 1: Escherichia coli na agarze EMB, intensywna fermentacja laktozy

E. coli na agarze EMB ma zwykle barwę od ciemnofioletowej do granatowoczarnej, często z ciemnym centrum i metalicznym zielonym połyskiem wynikającym z intensywnego wytwarzania kwasu. Połysk to charakterystyczna cecha, której szukają studenci, ale należy traktować go jako dowód pomocniczy, a nie cechę definiującą. Intensywność połysku zależy od szczepu, czasu inkubacji, zagęszczenia kolonii i kąta obserwacji. Brak połysku nie wyklucza E. coli, a ciemna kolonia bez połysku może wskazywać na kilka innych drobnoustrojów fermentujących. Do dalszych badań wybierz dobrze odizolowaną kolonię zamiast oceniać zagęszczony sektor.

Płytka 2: Klebsiella pneumoniae na agarze EMB, śluzowe kolonie drobnoustroju fermentującego

Klebsiella pneumoniae na agarze EMB zwykle tworzy duże, lśniące, śluzowe kolonie o odcieniach od różowofioletowego do brązowofioletowego, często z ciemnymi centrami, ale zazwyczaj bez silnego metalicznego połysku. Podobną morfologię mają pokrewne drobnoustroje fermentujące, takie jak Enterobacter. Śluzowatość i wielkość kolonii są częścią oceny: mała, płaska różowa kolonia ma inną wagę interpretacyjną niż duża, wypukła i śluzowa. Podobnie jak w przypadku E. coli, płytka wskazuje na fenotyp fermentacji, a identyfikacja na poziomie gatunku wymaga potwierdzenia biochemicznego opisanego poniżej.

Płytka 3: Salmonella na agarze EMB i inne drobnoustroje niefermentujące, bezbarwne kolonie

Salmonella na agarze EMB oraz pokrewne drobnoustroje niefermentujące laktozy, w tym Shigella i wiele izolatów Pseudomonas, zwykle rosną w postaci kolonii bezbarwnych, półprzezroczystych lub jasnobursztynowych. Niektóre receptury i warunki powodują lekko różowawy odcień, więc bladoróżowa kolonia nie oznacza automatycznie drobnoustroju fermentującego. EMB nie pozwala odróżnić Salmonella od Shigella ani od innych drobnoustrojów niefermentujących; to rozróżnienie wymaga dalszych testów. Warto też pamiętać, że udokumentowano szczepy Salmonella fermentujące laktozę, tworzące metalicznie połyskujące kolonie podobne do E. coli. To kolejny powód, dla którego pojedyncza płytka nie może rozstrzygnąć identyfikacji.

Płytka 4: Serratia marcescens i pułapka receptury podłoża

Serratia marcescens zasługuje na osobną sekcję, ponieważ studenci często oczekują czerwonych kolonii, a następnie błędnie interpretują płytkę. Większość izolatów klinicznych nie fermentuje laktozy, dlatego na EMB Levine’a zwykle wyglądają blado lub są słabo zabarwione. Ponieważ wiele izolatów fermentuje sacharozę, receptura zawierająca sacharozę może dawać ciemniejsze zabarwienie lub wyraźniejszą reakcję związaną z wytwarzaniem kwasu. Nie oczekuj też charakterystycznego czerwonego pigmentu, prodigiozyny, w temperaturze 35 do 37 C; jego wytwarzanie w temperaturze inkubatora jest zmienne. Gdy protokół opisuje Serratia marcescens na agarze EMB, sprawdź, jaką recepturę zakłada ten opis. Przegląd metabolizmu Serratia podsumowuje brak fermentacji laktozy i zmienną fermentację sacharozy, które leżą u podstaw tej pułapki.

Płytka 5: kontrole i drobnoustroje, których wzrost jest hamowany

Wzrost drobnoustrojów Gram-dodatnich, takich jak Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus i Bacillus, jest na agarze EMB zwykle hamowany lub znacznie ograniczany, choć nie w przypadku każdego szczepu hamowanie jest całkowite. Zestaw kontroli pozwala na rzetelną interpretację: kontrola E. coli powinna wykazywać dobry wzrost, granatowoczarne zabarwienie i połysk, kontrola drobnoustroju niefermentującego powinna wykazywać bezbarwny wzrost, a kontrola hamowania — niewielki wzrost lub jego brak. Jeśli kontrola hamowania rośnie dobrze, selektywność podłoża zawiodła i każdy inny odczyt z tej partii budzi wątpliwości. Metody barwienia odpowiadają na inne pytanie niż podłoża hodowlane; zagadnienia barwienia preparatów na szkiełku przedstawia atlas barwienia błękitem metylenowym.

Porównanie z uwzględnieniem ograniczeń

Trzy zdania podsumowują mylące cechy wyglądu. Ciemna barwa nie oznacza E. coli, ponieważ Klebsiella, Enterobacter i inne drobnoustroje fermentujące tworzą ciemne centra bez połysku. Różowa barwa nie oznacza Klebsiella, ponieważ drobnoustroje fermentujące umiarkowanie lub powoli oraz niektóre uznawane za niefermentujące mogą być różowe lub jasnofioletowe. Połysk nie oznacza definitywnie E. coli, ponieważ inne intensywnie fermentujące drobnoustroje również mogą go wytwarzać. Protokół dydaktyczny i zawarte w nim ilustracje hodowli mieszanych pokazują każdy z tych błędów interpretacyjnych.

Ograniczenia potwierdzania

Agar EMB wskazuje fenotyp, a nie gatunek. Różne drobnoustroje mogą mieć taki sam wygląd kolonii, a jeden drobnoustrój może odbiegać od obrazu podręcznikowego zależnie od szczepu, wieku, zagęszczenia, receptury podłoża i warunków inkubacji. Dlatego w procedurach dydaktycznych i klinicznych morfologię na EMB traktuje się jako podstawę identyfikacji wstępnej.

Rzetelna procedura dla studenta wygląda następująco: opisz odizolowaną kolonię (wielkość, kolor, centrum, połysk w świetle padającym ukośnie, śluzowatość), zapisz recepturę, czas i temperaturę inkubacji oraz kontrole; następnie przesiej dobrze odizolowaną kolonię, aby uzyskać czystą hodowlę przed wykonaniem jakiegokolwiek testu potwierdzającego. Typowe dalsze badania obejmują barwienie metodą Grama oraz reakcje IMViC do wstępnej identyfikacji E. coli i bakterii z grupy coli, podłoża TSI lub KIA i zestawy testów biochemicznych właściwe dla danego drobnoustroju w przypadku bakterii jelitowych, a także identyfikację serologiczną, MALDI TOF lub inną zwalidowaną metodą, jeśli wymaga tego zadanie. Aby poznać miejsce EMB wśród selektywnych i różnicujących podłoży dla bakterii jelitowych, zapoznaj się z wprowadzeniami do podłoży hodowlanych dla bakterii jelitowych oraz z barwieniem metodą Grama jako kolejnym etapem badania. Pokrewne zagadnienie — co może, a czego nie może dowieść niebieskie zabarwienie preparatu — omawia atlas barwienia błękitem metylenowym, który w podobny sposób oddziela obserwację od wniosku.

Zapisz obserwację przed wnioskiem. Stwierdzenie „Ciemne granatowoczarne kolonie z zielonym połyskiem zależnym od kąta obserwacji na EMB Levine’a po 24 godzinach, zgodne z intensywną fermentacją laktozy” jest uzasadnione. „E. coli, potwierdzone” wymaga etapu potwierdzenia, którego sama płytka nie zapewnia.