Kto opracował purpurowe barwienie krwi? Błękit metylenowy, Malachowski, Romanowsky i Giemsa

Eozyna jest czerwona. Błękit metylenowy jest niebieski. Po zmieszaniu obu barwników i naniesieniu mieszaniny na wysuszony rozmaz krwi niektóre jego części stają się purpurowe.

Nie wszystkie. W dobrym preparacie jądra białych krwinek przybierają czerwono-purpurową barwę, a chromatyna wewnątrz zarodźca malarii — ten sam kolor, podczas gdy otaczające go czerwone krwinki pozostają różowe, a cytoplazma szaroniebieska. To właśnie purpura pozwala rozróżnić typy komórek.

Żadna z butelek nie zawiera purpury. Kolor pojawia się dopiero wtedy, gdy określony produkt rozkładu błękitu metylenowego spotyka się z eozyną na szkiełku. W latach 80. i 90. XIX wieku nikt nie wiedział o istnieniu tego produktu, a tym bardziej nie znał jego tożsamości. Badacze poszukujący tego koloru pracowali samodzielnie z nieczystymi barwnikami, bez wiarygodnego sposobu ustalenia, co znajduje się w butelce po dwóch miesiącach stania na półce.

Dlatego na pytanie z tytułu można udzielić więcej niż jednej uzasadnionej odpowiedzi i dlatego odpowiedź zmieniła się w 2011 roku.

Obraz zmieniający się wraz z mieszaniną

Metody barwienia nie wynaleziono jednym krokiem. Powstawała stopniowo. Każda zmiana mieszaniny pozwalała zobaczyć dokładnie jeden nowy element, a kolejność tych elementów najlepiej ukazuje tę historię.

Najważniejsza jest prawidłowość widoczna w ostatniej kolumnie. Każdy postęp poszerzał gamę barw, a każde jej poszerzenie uwidaczniało kolejną strukturę. Purpura nie jest ozdobnikiem tej techniki; stanowi różnicę między dostrzeżeniem obecności pasożyta a zobaczeniem, z czego jest zbudowany. Droga samego barwnika z fabryki BASF do medycyny to dłuższa historia, mająca własną dokumentację. Pełny powyższy ciąg wydarzeń, ze źródłem dla każdego wpisu, znajduje się w chronologii wkładu poszczególnych badaczy z odnośnikami do źródeł.

Ilustracja: te same sześć mieszanin przedstawione jako zawartość naczynia i uzyskany rezultat. Okręgi pokazują barwniki, a prostokąty pod nimi — kolory, które te barwniki mogły wytworzyć w rozmazie krwi. Przed 1890 rokiem nie ma czerwono-purpurowego prostokąta; po tym roku nie brakuje go w żadnej mieszaninie.

Człowiek, który celowo użył boraksu

Ernst Malachowski był lekarzem we Wrocławiu, noszącym wówczas nazwę Breslau. Przez całą karierę prowadził prywatną praktykę i niewielką klinikę wraz z kolegą, a pracę laboratoryjną wykonywał w wolnym czasie. Urodził się w Strzelnie 12 marca 1857 roku, studiował medycynę na Uniwersytecie Wrocławskim, a od 1882 do 1887 roku pracował jako asystent na oddziale chorób wewnętrznych w Szpitalu Wszystkich Świętych, wówczas drugim co do wielkości szpitalu w Niemczech.

W 1888 roku zaczął od podwójnego barwienia Chęcińskiego i Plehna. W preparacie wykonanym w 1889 roku zauważył, że chromatyna jądra zarodźca barwi się inaczej niż cytoplazma, lecz nie potrafił odtworzyć tego efektu. Próbował zakwasić błękit metylenowy, co pogorszyło wynik. Spróbował alkalizacji boraksem — i to działało za każdym razem. Publicznie zaprezentował metodę 15 czerwca 1890 roku, a w sierpniu 1891 roku opublikował pełniejszy opis, zawierający instrukcję użycia boraksu. Zaznaczył, że barwienie trwa dwadzieścia cztery godziny, a wyniki są łatwo odtwarzalne.

Dwadzieścia cztery godziny to długo w laboratorium diagnostycznym, a jego publikacja nie poświęcała wiele uwagi purpurowo-czerwonej barwie jądra pasożyta. Niezależnie od przyczyny nikt nie podjął celowej alkalizacji błękitu metylenowego, dopóki Nocht nie zastosował jej ponownie w 1898 roku. Malachowski nigdy więcej nie pisał o barwieniu krwi.

Powód, dla którego do niedawna tak niewiele o nim wiedziano, tkwi w archiwach, a nie w żadnej tajemnicy. W literaturze medycznej zachowało się bardzo mało śladów jego życia, a ocalałe informacje dotarły jedną drogą. Jego córka Marie wyjechała z Niemiec do Londynu w 1939 roku, służyła w armii brytyjskiej i osiedliła się w Kanadzie, a jej zbiór dokumentów rodzinnych trafił do Instytutu Leo Baecka w Nowym Jorku. Jej brat Leo zginął podczas pierwszej wojny światowej. Jej siostra Eva została deportowana z Wrocławia do obozu przejściowego w Izbicy w kwietniu 1942 roku i nigdy nie wróciła. Jej matka Hedwig odebrała sobie życie 22 kwietnia 1942 roku, zamiast czekać na tę samą deportację. Malachowski zmarł w 1934 roku, zanim do tego wszystkiego doszło.

Historia rodziny, która kończy się w ten sposób, przestaje być przywoływana. Dwie publikacje, które przywróciły Malachowskiemu miejsce w historii rozwoju barwienia, obie wydane w 2011 roku, powstały na podstawie dokumentów archiwalnych z Poznania i Wrocławia oraz dokumentów Marie przechowywanych w Nowym Jorku.

Spleśniała butelka i szczęśliwy Rosjanin

Dmitri Romanowsky studiował medycynę w Wojskowej Akademii Medycznej w Petersburgu i przez większość kariery zajmował się malarią. W 1890 roku opublikował metodę, która na papierze była niemal identyczna z metodą Chęcińskiego: niezmodyfikowany błękit metylenowy i eozyna, z nieco większą ilością eozyny.

We wrześniu 1891 roku opublikował metodę, która przyniosła mu sławę, a istotny szczegół był ukryty w instrukcji. Najlepsze wyniki uzyskiwał z przechowywanego roztworu błękitu metylenowego — roztworu zapasowego, który stał ponad dwa miesiące i na którym rosła pleśń. Pleśń i czas przechowywania spowodowały częściową demetylację barwnika. Romanowsky o tym nie wiedział i nie potrafił tego kontrolować, a inni badacze próbujący jego metody nie uzyskiwali purpury. Jego rozprawa została złożona w Petersburgu w czerwcu 1891 roku, dlatego standardowy opis uznaje 1891 za rok odkrycia.

Pokaz Malachowskiego odbył się w czerwcu 1890 roku, ponad rok wcześniej, a jego metoda działała w sposób zamierzony.

Dlaczego metodę nazwano imieniem niewłaściwego człowieka

Argumenty za pierwszeństwem Malachowskiego zebrali Kristine Krafts, Ernst Hempelmann i Barbara Oleksyn, opierając je na czterech kwestiach. Dacie publicznego pokazu: czerwiec 1890 wobec września 1891. Słowie celowy przeciwstawionym słowu przypadkowy. Fakcie, że Malachowski opublikował swoją metodę, wraz z użyciem boraksu, podczas gdy metoda Romanowsky’ego zależała od niekontrolowanej zmiennej. Oraz obserwacji, że opis jądra zarodźca wraz z uwidaczniającą je purpurą praktycznie zniknął z literatury na siedem lat, ponieważ nikt nie potrafił odtworzyć przypadkowo uzyskanego wariantu.

Ich wniosek jest bezpośredni. W publikacji biograficznej nazywają to przypisanie zasług „kpiną” i przytaczają Ralpha Lilliego, który w 1978 roku napisał, że „być może powinniśmy nazywać tę rodzinę barwień barwieniami Malachowskiego”.

Roszczenie to jest kwestionowane, jak zwykle bywa z roszczeniami do pierwszeństwa, a charakter sporu warto raczej wyjaśnić niż rozstrzygać. Dyskusja o pierwszeństwie wymaga określenia, co właściwie było odkryciem. Jeśli odkryciem jest purpurowy kolor, Malachowski ma wcześniejszy udokumentowany pokaz. Jeśli odkryciem jest opublikowana metoda, obaj badacze publikowali w 1891 roku, a nazwa przypadła Romanowsky’emu. Jeśli odkryciem jest wyjaśnienie, żaden z nich nie może rościć sobie pierwszeństwa, ponieważ żaden nie wiedział, że dojrzewanie oznacza demetylację, i żaden nie potrafił wyjaśnić, dlaczego kolor w ogóle się pojawia. Ten ostatni punkt jest pomijany w popularnych opisach. Aktywny składnik był zanieczyszczeniem, którego nikt nie zidentyfikował, a pierwsza osoba, która celowo uzyskała ten kolor, zrobiła to na podstawie powtarzalnej receptury empirycznej, nie rozumiejąc jej działania.

Dwie publikacje z 2011 roku stanowią najpełniejsze opublikowane przedstawienie argumentów za Malachowskim. Obie można przeczytać bezpłatnie za pośrednictwem PubMed: obszerny przegląd pod PMID 21235291 i artykuł biograficzny pod PMID 21660627. Rekord przeglądu w PubMed wymienia też komentarz do niego, opublikowany w tym samym czasopiśmie później w tym samym roku, pod oznaczeniem 86(5):366. To stosowne przypomnienie, że argumenty zakwestionowano w druku od razu po ich ukazaniu się.

Spór nie dotyczy chemii. Wszyscy uczestnicy zgadzają się co do tego, czym jest purpura i które składniki ją wytwarzają. Różnica zdań dotyczy tego, kto uzyskał ją pierwszy, oraz tego, czy przypadek, którego nikt nie potrafił powtórzyć, w ogóle można uznać za osiągnięcie tego celu.

Co wnieśli późniejsi badacze

Jeśli Malachowski pierwszy uzyskał purpurę, dlaczego barwienie nosi nazwiska Romanowsky’ego, Wrighta i Giemsy?

Ponieważ mieszanina, która działa raz w rękach swojego twórcy, nie jest jeszcze odczynnikiem. Późniejsze prace zmieniły kapryśną mieszaninę w coś, czego technik w innym kraju mógł użyć w zwykły wtorek.

Nocht doszedł do tego drogą rozumowania. Gdy nie udało mu się uzyskać powtarzalnego wyniku za pomocą prostego barwnika obojętnego, uznał, że purpura musi pochodzić od czegoś obecnego w błękicie metylenowym, co nie jest błękitem metylenowym, i zaczął tego szukać. Unna zauważył już wcześniej, że starzejące się roztwory błękitu metylenowego barwią ziarnistości komórek tucznych na czerwono, i wysunął przypuszczenie, że podczas dojrzewania barwnika powstaje nowa substancja. Bernthsen wykazał w 1885 roku, że warunki zasadowe powodują odszczepianie grup metylowych od błękitu metylenowego, a powstające produkty to substancje nazywane dziś azurami. Nocht wyekstrahował aktywną frakcję chloroformem i mógł określić ją jedynie jako czerwień z błękitu metylenowego; Michaelis nazwał ją azurem I w 1901 roku. Jenner rozwiązał problem praktyczny. Ponowne rozpuszczenie osadu błękitu metylenowego i eozyny w metanolu absolutnym dawało jeden stabilny roztwór, który utrwalał rozmaz podczas barwienia i eliminował konieczność utrwalania termicznego. Leishman i Reuter połączyli barwnik polichromowany z rozpuszczalnikiem alkoholowym, uzyskując jednocześnie stabilność i purpurę. Wright zastąpił dwunastogodzinną inkubację w 65 °C i dziesięć dni odstawienia jedną godziną w strumieniu pary wodnej. Giemsa całkowicie zrezygnował z polegania na przypadkowo dojrzewającym roztworze, stosując odmierzone ilości znanych barwników z dodatkiem glicerolu do metanolu, dzięki czemu preparat zachowywał właściwości w tropikalnym upale. Nigdy nie opublikował sposobu otrzymywania czystego azuru metylenowego. Sprzedawał go laboratorium dra Grüblera w Lipsku, które wprowadziło go na rynek jako azur I i twierdziło, że tylko jego wersja jest autentycznym barwnikiem Giemsy.

Tożsamość tego azuru nadal jest przedmiotem dyskusji. Niektórzy uważają, że był to po prostu polichromowany błękit metylenowy, inni — że zawierał dużo Azure B. Odpowiedź przyniosła wojna. Gdy niemieckie barwniki stały się niedostępne, zespół amerykańskiej Publicznej Służby Zdrowia — Ralph Lillie, Maurice Roe i Aimee Wilcox — ustalił, że najlepsze barwienie dają trzy wyodrębnione składniki: niezmodyfikowany błękit metylenowy, produkt jego rozkładu powstający przez demetylację, Azure B, oraz eozyna. Azure B zastąpił niedostępny azur I, a te trzy składniki nadal stanowią podstawę barwienia stosowanego dziś do rozpoznawania malarii.

Chemia oddziaływań tych trzech składników na szkiełku to osobne zagadnienie i temat innej strony. Artykuł o rolach barwników i chemii barwień typu Romanowsky’ego omawia działanie Azure B i eozyny oraz wyjaśnia, dlaczego razem dają kolor, którego żaden z nich nie wytwarza samodzielnie. Strona poświęcona mikroskopii i zastosowaniom laboratoryjnym obejmuje stronę praktyczną: co uwidacznia dany preparat i jak ocenić, czy konkretny produkt nadaje się do planowanej metody.

Część historii, która pozostaje aktualna

Jeden szczegół tej historii nie stracił aktualności w 1902 roku. Przez około pięćdziesiąt lat najważniejszym składnikiem standardowego barwnika używanego na świecie do rozpoznawania malarii było nienazwane zanieczyszczenie. Znajdowało się tam przypadkiem, jego ilość różniła się między butelkami, przez część tego okresu jego tożsamość była tajemnicą handlową, a o jego udział spierano się aż do lat 40. XX wieku. Osoby stosujące barwnik nie były niedbałe. Nie miały sposobu, by dowiedzieć się, co znajduje się w butelce.

Współczesną wersją tego samego problemu jest specyfikacja opisująca tylko część materiału. Zgodność z USP to droga do najwyższej czystości dostępnej na rynku, ponieważ jest to kompletny, opublikowany standard, a nie pojedynczy pomiar: tożsamość, czystość, zanieczyszczenia organiczne, w tym barwniki azurowe, pozostałości rozpuszczalników, zanieczyszczenia pierwiastkowe, pozostałość po prażeniu, limity mikrobiologiczne i endotoksyny bakteryjne. Blupreme pozyskuje błękit metylenowy od producenta farmaceutycznego i publikuje pełny certyfikat analizy, aby każdy punkt tej listy można było sprawdzić, zamiast poprzestawać na deklaracji. Certyfikat, który podaje wynik badania metali ciężkich i nazywa to zgodnością z USP, jest dzisiejszym odpowiednikiem butelki z etykietą „dojrzały błękit metylenowy”: być może zawiera dobry odczynnik, ale etykieta nie mówi, co w nim jest.