Artykuł
Błękit metylenowy w badaniach laboratoryjnych G6PD: jaka jest rzeczywista rola barwnika
Student obserwuje dwie probówki po inkubacji. Zawartość jednej przybrała oczekiwaną barwę. Drugiej — nie. Student wnioskuje, że drugi pacjent ma niedobór dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej. Ten wniosek może być prawidłowy, ale rozumowanie pomija zasadę, na której opiera się test. W probówce nic nie mierzy enzymu bezpośrednio. Mierzy się to, co enzym wytwarza, wykorzystując błękit metylenowy jako pośrednika.
Gdy ten pośredni mechanizm staje się jasny, procedura, próby kontrolne i długa lista fałszywych wyników przestają wyglądać na arbitralne.
Krótka odpowiedź
Błękit metylenowy w badaniach G6PD jest wskaźnikiem redoks. Enzym G6PD wytwarza NADPH, a układy zależne od NADPH redukują niebieski błękit metylenowy do jego bezbarwnej formy leuko lub wykorzystują go do przenoszenia elektronów. Prawidłowa aktywność enzymu zapewnia sprawną redukcję. Obniżona aktywność powoduje powolną lub niepełną redukcję. To cały sygnał pomiarowy.
Dwie historyczne metody wykorzystują ten sam barwnik, ale różnią się punktem końcowym. Ich rozróżnienie usuwa większość nieporozumień.
Dwa testy, jeden barwnik, różne punkty końcowe
Pierwszy to bezpośredni test redukcji błękitu metylenowego, opisany przez Sassa i współpracowników, a później oceniony przez Gibbsa. Tutaj punktem końcowym jest sam barwnik: utleniony, niebieski błękit metylenowy jest redukowany do bezbarwnego leukobłękitu metylenowego, a szybkość tej zmiany odzwierciedla zdolność wytwarzania NADPH. Pierwotna publikacja dotycząca badania przesiewowego jest indeksowana w PubMed jako praca Sassa i współpracowników (1966).
Drugi to test redukcji methemoglobiny Brewera. Azotyn sodu najpierw utlenia hemoglobinę do brązowej methemoglobiny. Następnie błękit metylenowy działa jako mediator przenoszenia elektronów: zredukowany błękit metylenowy przekazuje równoważniki redukcyjne methemoglobinie, przekształcając ją z powrotem w czerwoną hemoglobinę. Widoczny punkt końcowy dotyczy więc barwy brązowej i czerwonej, a nie niebieskiej i bezbarwnej. Oryginalna metoda została opublikowana w Biuletynie Światowej Organizacji Zdrowia (Brewer i współpracownicy, 1960).
Nazywanie testu Brewera testem odbarwiania barwnika jest chemicznie nieprecyzyjne. Barwnik przechodzi cykl przemian; to hemoglobina zmienia barwę. Poniższy schemat przedstawia oba szlaki.
Reakcja leżąca u podstaw testu
G6PD katalizuje pierwszy etap utleniania w szlaku pentozofosforanowym:
Glukozo-6-fosforan + NADP+ przekształca się w 6-fosfoglukonolakton + NADPH + H+
Dojrzałe krwinki czerwone w dużym stopniu zależą od tego szlaku jako źródła NADPH, co omówiono w pracy przeglądowej Luzzatta i współpracowników w czasopiśmie Blood (2020). NADPH utrzymuje glutation w stanie zredukowanym i chroni komórkę przed uszkodzeniem oksydacyjnym. Błękit metylenowy włącza się w ten układ jako akceptor elektronów. Wystarczająca aktywność G6PD zapewnia wystarczającą ilość NADPH, co umożliwia sprawną redukcję. Niska aktywność G6PD przerywa ten łańcuch już na pierwszym ogniwie.
Traktuj barwnik jak wskaźnik poziomu paliwa, a nie silnik. Informuje o dostępności NADPH. Wszystko, co zmienia tę dostępność lub odczyt, może przesunąć wskazanie bez jakiejkolwiek zmiany w genie.
Jak przebiega procedura typu Brewera
Skład odczynników zmieniał się na przestrzeni dekad, dlatego opisu dydaktycznego nie należy mylić z protokołem klinicznym. Każde laboratorium stosuje własną zwalidowaną standardową procedurę operacyjną. Z tym zastrzeżeniem klasyczny układ probówkowy działa następująco, w wersji obejmującej trzy probówki i 3-godzinną inkubację, udokumentowanej w tej opublikowanej procedurze:
- Probówka pacjenta: krew pełna z dodatkiem glukozy, azotynu sodu i błękitu metylenowego. Azotyn wytwarza methemoglobinę, glukoza dostarcza substratu dla metabolizmu krwinek czerwonych, a barwnik zapewnia zależne od NADPH przenoszenie elektronów.
- Kontrola utleniona: krew z dodatkiem azotynu i glukozy, ale bez błękitu metylenowego. Pokazuje brązową barwę methemoglobiny w punkcie końcowym, odpowiadającą wzorcowi niedoboru.
- Kontrola hemoglobiny: krew z dodatkiem wody. Pokazuje czerwoną barwę hemoglobiny w punkcie końcowym, odpowiadającą wzorcowi prawidłowemu.
- Inkubuj wszystkie probówki w temperaturze około 37 C, zwykle przez 3 godziny, delikatnie mieszając.
- Rozcieńcz niewielką porcję zawartości każdej probówki w wodzie destylowanej, aby doprowadzić do lizy komórek i umożliwić czytelne porównanie barw.
- Porównaj probówkę pacjenta z dwiema próbami kontrolnymi. Powrót w kierunku czerwieni wskazuje na znaczną zdolność redukcyjną. Utrzymywanie się brązowej barwy sugeruje znaczny niedobór.
W jednym z historycznych wariantów używano około 1 mL krwi oraz odczynników o stężeniach około 180 mM azotynu sodu, 280 mM dekstrozy i 0.4 mM błękitu metylenowego. Traktuj te liczby jako przykład z piśmiennictwa, a nie uniwersalną specyfikację.
Odczytywanie wyniku
| Wzorzec | Wygląd w teście Brewera | Znaczenie |
|---|---|---|
| Prawidłowy | Barwa w probówce pacjenta zbliża się do czerwonej kontroli hemoglobiny | Zdolność redukcyjna powyżej progu badania przesiewowego |
| Niedoborowy | Zawartość probówki pacjenta pozostaje brązowa, podobnie jak kontrola methemoglobiny | Badanie przesiewowe sugeruje znaczny niedobór G6PD |
| Pośredni | Barwa mieści się pomiędzy barwami prób kontrolnych | Nie przypisuj fenotypu; zmierz aktywność ilościowo |
Jakościowe badanie przesiewowe najlepiej rozróżnia wyniki w okolicy 30 do 40 procent prawidłowej aktywności, co omówiono w tym przeglądzie luk w wykrywaniu niedoboru G6PD w czasopiśmie Malaria Journal. Prawidłowy wynik badania przesiewowego oznacza zatem, że test nie wykrył ciężkiego niedoboru. Nie potwierdza on w pełni prawidłowej aktywności.
Dlaczego badania przesiewowe mogą wprowadzać w błąd
Retikulocytoza po hemolizie to klasyczna przyczyna wyniku fałszywie prawidłowego. Młode krwinki czerwone i retikulocyty zawierają więcej G6PD niż stare komórki. Podczas ostrego epizodu hemolitycznego najstarsze komórki, z największym niedoborem, mogą być już zniszczone, pozostawiając młodą populację, której aktywność w badaniu wypada prawidłowo. Ten sam mechanizm biologiczny zaburza wyniki testów ilościowych, nie tylko badań przesiewowych z użyciem barwnika.
Niedawna transfuzja maskuje niedobór, ponieważ krwinki czerwone dawcy wnoszą do próbki własny enzym. Mayo Clinic Laboratories wymienia transfuzję wśród przyczyn niewiarygodnych wyników oznaczeń enzymatycznych, obok retikulocytozy i interferencji ze strony leukocytów.
Kobiety heterozygotyczne stanowią najtrudniejszy przypadek. Losowa inaktywacja chromosomu X prowadzi do powstania mieszaniny krwinek czerwonych prawidłowych i niedoborowych, a łączna aktywność może mieścić się w dowolnym miejscu zakresu od ciężkiego niedoboru po pozornie prawidłową wartość. Jakościowe badania przesiewowe często nie wykrywają fenotypów pośrednich. Dokumentacja WHO dotycząca badań G6PD szczegółowo omawia to ograniczenie.
Czas od pobrania próbki, temperatura przechowywania, subiektywność wzrokowej oceny punktu końcowego, hematokryt i jakość odczynników dokładają szum analityczny do tych czynników biologicznych.
Badanie przesiewowe nie jest rozpoznaniem
Wynik badania przesiewowego wskazujący na niedobór, pośredni lub niezgodny z obrazem klinicznym wymaga ilościowego oznaczenia aktywności enzymu G6PD. WHO uznaje spektrofotometrię ilościową z kontrolą temperatury za metodę referencyjną. W tym oznaczeniu do hemolizatu krwinek czerwonych dodaje się glukozo-6-fosforan i NADP+, a powstający NADPH śledzi się na podstawie wzrostu absorbancji przy 340 nm. Szybkość zmiany jest proporcjonalna do aktywności enzymu, zwykle przeliczanej na zawartość hemoglobiny i wyrażanej w jednostkach na gram. Aktualną praktykę laboratoriów klinicznych podsumowano w opisie oznaczenia aktywności G6PD w katalogu badań Mayo.
Interpretacja wykorzystuje zwalidowany przez laboratorium zakres referencyjny, często odnoszony do prawidłowej aktywności w populacji; niedobór zwykle omawia się w odniesieniu do progu 30 procent, a aktywność pośrednią — powyżej tego progu. Docelowe profile produktów WHO dla testów G6PD (2022) przedstawiają te ramy diagnostyczne. Jeśli niedawna hemoliza lub transfuzja sprawia, że określenie fenotypu jest niewiarygodne, należy powtórzyć badanie po ponownym ustabilizowaniu się populacji krwinek czerwonych; badania molekularne mogą dostarczyć dodatkowych informacji, ale nie zastępują pomiaru aktywności enzymu.
Rozróżnienie, które warto zachować
Błękit metylenowy w tych testach jest odczynnikiem laboratoryjnym stosowanym ex vivo. To odrębna kwestia od bezpieczeństwa podawania błękitu metylenowego pacjentowi, omówionego we wskazówkach dotyczących przeciwwskazań do stosowania błękitu metylenowego. Biochemia łączy te zagadnienia, ponieważ lek również zależy od redukcji z udziałem NADPH, ale barwnik w probówce nie jest dawką w krwiobiegu. Aby poznać działanie barwnika przy wybarwianiu w innym zastosowaniu, zobacz zasady barwienia błękitem metylenowym, a informacje o grupie chemicznej, do której należy, znajdziesz w omówieniu barwników redoks w laboratorium.
Badanie przesiewowe odpowiada na pytanie, czy zdolność redukcyjna wydaje się zachowana. Badanie potwierdzające pyta, ile enzymu rzeczywiście jest obecne. Barwnik dobrze służy odpowiedzi na pierwsze pytanie, pod warunkiem że nikt nie oczekuje od niego odpowiedzi na drugie.