Testy drożdży z błękitem metylenowym: liczenie żywych komórek a pomiar czasu oddychania

Na stole laboratoryjnym stoją dwie probówki. Obie są niebieskie. W jednej niebieskie komórki widoczne pod mikroskopem oznaczają martwe drożdże. W drugiej zmiana zawartości probówki z niebieskiej na bezbarwną oznacza, że drożdże żyją i oddychają. Ten sam barwnik, przeciwne interpretacje. Pomylenie tych dwóch testów odwraca każdy wniosek.

Cały artykuł dotyczy tego rozróżnienia. Błękit metylenowy jest barwnikiem redoks: w postaci utlenionej jest niebieski, a w postaci zredukowanej staje się bezbarwnym leukobłękitem metylenowym. Zliczanie komórek w celu oceny żywotności wykorzystuje tę reakcję w krótkiej obserwacji mikroskopowej. Doświadczenie dotyczące oddychania wykorzystuje ją w reakcji zachodzącej w całej objętości próbki, z pomiarem czasu. Każdy test wymaga własnego protokołu, własnych kontroli i własnej dozy sceptycyzmu.

Ocena żywotności przez zliczanie: krótkie barwienie i szybki odczyt

Protokół stosowany w browarnictwie jest najbardziej ustandaryzowaną wersją. Przygotuj błękit metylenowy o stężeniu 0.01% w/v w 2% roztworze cytrynianu sodu, wymieszaj go w proporcji 1:1 z zawiesiną drożdży i zbadaj mieszaninę po krótkim, ustalonym czasie. Opublikowane czasy wahają się od 1 do 2 minut w podręczniku Brewing Science Institute do około 5 minut w protokołach badawczych, natomiast metoda mikrobiologiczna OIV dla wina wymaga przeprowadzenia obserwacji w ciągu 10 minut. Końcowe stężenie barwnika w mieszaninie do zliczania wynosi około 0.005%. Napełnij ulepszoną komorę Neubauera i przy powiększeniu około 400x klasyfikuj ciemnoniebieskie komórki jako nieżywotne, a niezabarwione jako żywotne. W metodzie OIV jasnoniebieskie komórki uznaje się za żywe, co już wskazuje na problem subiektywności omówiony poniżej.

Stężenie komórek wynika z geometrii komory. Gdy zlicza się cały centralny kwadrat o boku 1 mm, liczba komórek na mL jest równa N razy współczynnik rozcieńczenia razy 10^4, gdzie N oznacza liczbę komórek w tym obszarze, zgodnie z metodami ASBC dotyczącymi drożdży. Żywotność oblicza się prościej: liczba niezabarwionych komórek podzielona przez całkowitą liczbę komórek, razy 100. Aby oszacować żywotność, zlicz około 400 komórek, zgodnie z badaniem porównawczym FEMS dotyczącym browarnictwa i praktyką OIV. Stosuj konsekwentnie jedną regułę dotyczącą granic, na przykład uwzględniaj komórki na dolnych i lewych liniach siatki, a pomijaj te na górnych i prawych.

Regułę dotyczącą pączków trzeba ustalić przed rozpoczęciem zliczania. Często stosowana konwencja nakazuje liczyć pączek jako osobną komórkę, gdy osiągnie około połowy wielkości komórki macierzystej, a mniejszy pączek — razem z nią. Niezależnie od wybranej reguły stosuj ją w każdym kwadracie i zapisz w arkuszu, aby kolejna osoba mogła ją odtworzyć.

Arkusz zliczania (do wydrukowania)

Ten arkusz jest autorskim materiałem przygotowanym do artykułu. Przepisz go do zeszytu lub wydrukuj po jednym egzemplarzu na każdą próbkę.

Żywotność (%) = 100 x niezabarwione / (niezabarwione + ciemnoniebieskie). Całkowita liczba komórek na mL = N x współczynnik rozcieńczenia x 10^4, gdzie N pochodzi ze zdefiniowanego obszaru komory. Zapisz czas barwienia obok wyniku, ponieważ wartości żywotności bez informacji o czasie nie da się odtworzyć.

Dlaczego wyniki oceny żywotności się zmieniają

Pierwszym czynnikiem zakłócającym jest czas, a jego wpływ działa w obie strony. Komórki aktywne metabolicznie redukują barwnik, więc wczesny odczyt może uchwycić żywe komórki, zanim zakończą jego redukcję, i błędnie sklasyfikować je jako martwe. Jednak długotrwała ekspozycja sama w sobie jest toksyczna i prowadzi do powstania rzeczywiście uszkodzonych, niebieskich komórek, dając fałszywy sygnał obumarcia. Dlatego laboratoryjny protokół dydaktyczny określa, że ocenę należy przeprowadzić w ciągu 5 minut, co udokumentowano w protokole dydaktycznym dotyczącym drożdży z Wisconsin. Najbezpieczniej przyjąć, że ocena z użyciem błękitu metylenowego zależy od czasu, ustalić jeden krótki odstęp i zachować go dla każdej próbki w serii.

Próbki o niskiej żywotności wiążą się z drugim źródłem błędu. Ustandaryzowana metoda ostrzega, że błękit metylenowy może zawyżać rzeczywistą żywotność poniżej około 80%, ponieważ komórki, które nadal redukują barwnik, nie muszą zachowywać zdolności do rozmnażania. Literatura browarnicza opisuje tę samą zawodność przy znacznym spadku żywotności. Traktuj błękit metylenowy jako narzędzie do szybkiego, przybliżonego oszacowania, a kluczowe decyzje przy niskiej żywotności, takie jak ponowne użycie kultury do zaszczepienia, potwierdzaj przez zliczanie kolonii na płytkach lub uzupełniające barwienie.

Trzecim czynnikiem jest wpływ matrycy. Metoda OIV przebiega przy pH około 4.6 i ostrzega, że silnie buforowane próbki o niskim pH uniemożliwiają prawidłowe zachowanie barwnika. Odradza też stosowanie testu przy zawartości cukru powyżej 100 g/L, kiedy komórki przybierają mylące jasnoniebieskie zabarwienie. Eksperymentalne porównanie pH barwienia wykazało znaczne zmiany czułości w badanym zakresie, zgodne z badaniem metody z błękitem metylenowym zależnej od pH. Osobną pułapką są zanieczyszczenia: zabarwione cząstki w zanieczyszczonych zacierach przypominają martwe komórki i zwiększają rozbieżności między osobami wykonującymi ocenę.

Ta zmienność została zmierzona, a nie tylko zaobserwowana anegdotycznie. W sześciomiesięcznym badaniu browarniczym opisanym w porównaniu metod oceny drożdży FEMS odchylenie standardowe powtórnych pomiarów z błękitem metylenowym wynosiło średnio 6.1%, wobec 0.2% dla cytometrii przepływowej z oksonolem, a wyniki dwóch osób dla tej samej próbki różniły się nawet o 13 punktów procentowych. Ilościowe porównanie metod oceny żywotności z 2023 roku wykazało znacznie większą precyzję mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej, pokazując jednocześnie, że jakość wyników zależy od gatunku i matrycy. Klasyczny opis metody autorstwa Paintinga i Kirsopa (PMID 24430080) pozostaje punktem odniesienia, a szerszy przegląd testów żywotności i witalności drożdży (PMID 25154541) umieszcza błękit metylenowy wśród testów uzupełniających, a nie rozstrzygających. Błękit trypanu nie jest tutaj automatycznie lepszą alternatywą: wskazuje utratę integralności błony, podczas gdy błękit metylenowy wskazuje pobieranie barwnika oraz aktywność redukującą, więc komórki poddane stresowi mogą być różnie klasyfikowane przy użyciu tych dwóch barwników.

Doświadczenie dotyczące oddychania: zmierz czas zaniku błękitu

Drugi test nie wymaga patrzenia przez mikroskop. Drożdże, glukoza i rozcieńczony błękit metylenowy trafiają do zamkniętej probówki, a zegar mierzy czas potrzebny do zaniku niebieskiej barwy. Podczas metabolizmu komórki wytwarzają równoważniki redukujące, które przekształcają niebieski barwnik w jego bezbarwną postać, natomiast rozpuszczony tlen utlenia go z powrotem. Gdy komórki obniżą zawartość tlenu, redukcja zaczyna przeważać i zawartość probówki się odbarwia. Punkt końcowy odzwierciedla więc równowagę między oddychaniem, stężeniem barwnika i dostępnością tlenu. Należy go podawać jako czas redukcji lub odbarwienia błękitu metylenowego, a nie jako bezpośrednią szybkość zużycia tlenu cząsteczkowego.

Użyj znacznie bardziej rozcieńczonego barwnika niż przy ocenie żywotności, aby pomiar mieścił się w dogodnym przedziale czasu. Podręcznik obowiązkowych ćwiczeń praktycznych AQA na poziomie A level dobrze to standaryzuje: 1 g glukozy na 100 mL wody ogrzanej do około 30 C, 5 g suszonych drożdży dodanych bezpośrednio przed użyciem oraz roboczy roztwór barwnika o stężeniu około 0.001%, przygotowany przez rozcieńczenie 0.1 mL roztworu wyjściowego o stężeniu 1% do 100 mL. Wymieszaj 2 mL zawiesiny drożdży z glukozą z 2 mL roboczego roztworu barwnika, doprowadź do temperatury badania, wstrząsaj raz przez 10 sekund, uruchom stoper i nie wstrząsaj ponownie. Wstrząsanie ponownie wprowadza tlen i przywraca niebieską barwę zawartości probówki, co jest największym pojedynczym artefaktem proceduralnym. AQA podaje, że preparat powinien zwykle odbarwić się w ciągu około 5 minut przy 35 C, a średnie czasy w próbach wynosiły 275 s przy 20 C, 128 s przy 35 C i 145 s przy 45 C. Są to przykłady z jednego układu doświadczalnego, a nie uniwersalne wartości odniesienia. Ilościowy związek między szybkością redukcji a aktywnością metaboliczną drożdży w kontrolowanych warunkach potwierdzają badania poświęcone redukcji, w tym praca indeksowana jako PMID 25773544 oraz badanie mechanizmu opublikowane w Yeast (2014).

Przykład przebiegu w czasie (materiał autorski)

Poniższa tabela jest autorskim przykładem przygotowanym do tego artykułu z wykorzystaniem opisanego wyżej układu w stylu AQA: 2 mL mieszaniny drożdży z glukozą oraz 2 mL roboczego roztworu barwnika o stężeniu około 0.001%, jednorazowe wstrząsanie przez 10 sekund, a następnie inkubacja bez poruszania. Wpisy są przykładowymi odczytami w formacie, który powinna stosować grupa uczniów. Wskaźnik szybkości zdefiniowano jako 1 podzielone przez czas odbarwienia w sekundach. Przeprowadź doświadczenie z takim samym zestawem probówek i zastąp te wpisy zmierzonymi wartościami.

Wykreśl wskaźnik szybkości w zależności od temperatury dla probówek A, B i C. Krzywa najpierw rośnie, a następnie się wypłaszcza lub opada — to oczekiwany przebieg procesu zależnego od enzymów, a nie linia prosta. Probówki D, E i F nie są punktami danych na tej krzywej. To kontrole, które umożliwiają jej interpretację.

Kontrole, które nadają znaczenie każdemu testowi

Każde doświadczenie dotyczące oddychania wymaga trzech prób towarzyszących. Przegotowane lub uśmiercone drożdże z glukozą i barwnikiem powinny pozostać niebieskie, co dowodzi, że szybka redukcja zależy od metabolizmu żywych komórek. Żywe drożdże z barwnikiem, ale bez dodanej glukozy, stanowią kontrolę substratową. Mimo to należy oczekiwać powolnego odbarwiania, ponieważ drożdże zużywają zapasy endogenne. Glukoza z barwnikiem bez drożdży stanowi chemiczną próbę ślepą, niezbędną dlatego, że glukoza w środowisku zasadowym może redukować błękit metylenowy nawet bez obecności komórek.

Zliczanie komórek w celu oceny żywotności wymaga innego rodzaju kontroli: niezmienności procedury. Ten sam roztwór wyjściowy barwnika, ta sama proporcja mieszania, ten sam czas barwienia, ten sam obszar komory, te same reguły dotyczące pączków i granic oraz, w miarę możliwości, zliczanie w sposób zaślepiony. Gdy wyniki dwóch osób różnią się o dziesięć punktów, arkusz zwykle ujawnia przyczynę: inny czas, inny próg uznania komórki za niebieską lub inne reguły dotyczące pączków. Techniki przygotowania i oglądania zabarwionych komórek wiążą się z prostymi metodami barwienia bakterii, natomiast szerszy przegląd tego, co barwnik uwidacznia w różnych preparatach, znajduje się w atlasie barwień mikroskopowych. Jeśli chodzi o fizyczne podstawy ilościowego odczytu intensywności błękitu, opis warunków oznaczony jako odniesienie absorpcji wyjaśnia, dlaczego każdemu współczynnikowi muszą towarzyszyć informacje o rozpuszczalniku, pH i stężeniu.

Wybierz test zgodnie z pytaniem. Pytanie o to, ile komórek żyje w danej chwili, wymaga zliczania pod mikroskopem z użyciem arkusza. Pytanie o to, jak aktywnie oddycha dana kultura, dotyczy kinetyki i wymaga stopera oraz probówek w kontrolowanych warunkach. Błękit metylenowy służy do obu celów, ale nigdy w tej samej probówce jednocześnie.