Błękit metylenowy a SLA: dlaczego wyniki różnią się między modelami doświadczalnymi

Wyszukując informacje o błękicie metylenowym i SLA, można znaleźć dwa pozornie sprzeczne twierdzenia. Według jednego niebieski barwnik chronił neurony w modelach SLA. Według drugiego nie przyniósł żadnego efektu u myszy z modelem SLA. Oba twierdzenia odwołują się do rzeczywistych publikacji i obie publikacje zasługują na poważne potraktowanie. Sprzeczność znika, gdy jasno określimy zasadę stojącą za każdym eksperymentem: model wyznacza zakres twierdzenia.

Wynik uzyskany u nicienia mówi coś o nicieniu. Wynik uzyskany u larwy ryby mówi coś o larwie ryby. Żaden z nich nie mówi niczego o pacjencie, dopóki nie potwierdzą tego badania przebiegu choroby u ssaków. W tym artykule zestawiono dwie najczęściej cytowane publikacje, aby pokazać, dlaczego przynoszą różne odpowiedzi.

Dwa eksperymenty w jednej tabeli

Podczas lektury miej tę tabelę pod ręką. Zawiera wszystkie istotne różnice między badaniami.

Różnią się podłoże genetyczne, gatunki, droga podania, moment rozpoczęcia leczenia i punkty końcowe. Genotyp to tylko jedna z pięciu różnic, więc zestawienie tych badań nie może dowieść, że błękit metylenowy działa wybiórczo na jeden szlak związany z SLA. Dowodzi czegoś węższego, ale nadal użytecznego: wyraźna poprawa przy wczesnej, bezpośredniej ekspozycji w prostych modelach nie przełożyła się na efekt podczas przebiegu choroby u ssaków przy przewlekłym podawaniu doustnym.

Wynik pozytywny: co wykazało badanie na nicieniach i rybach

W badaniu na nicieniach i rybach z 2012 roku wywołano ekspresję zmutowanego ludzkiego TDP-43 lub FUS w neuronach ruchowych nicieni oraz wstrzyknięto zmutowane ludzkie mRNA do zarodków ryb. Są to modele proteotoksyczności. Odtwarzają toksyczny wpływ zmutowanego białka na ruch i kształt neuronów w ciągu dni, a nie pełny, wieloletni przebieg SLA u dorosłego człowieka.

Podawanie związku rozpoczęto bardzo wcześnie. Nicienie od wyklucia rozwijały się na agarze zawierającym błękit metylenowy. Zarodki ryb pozostawały przez noc w roztworze leku, począwszy od 24 godzin po zapłodnieniu, a ich zachowanie badano około dwóch dni później. Bariera krew–mózg nie oddzielała leku od neuronów w taki sposób jak u ssaka, a stężenia leku w osoczu ani w mózgu nie zmierzono.

W tych warunkach efekty były duże i spójne. Zarówno 6, jak i 60 μM ograniczało narastający z wiekiem paraliż u nicieni z TDP-43 i FUS. W 12. dniu dorosłego życia około 80 procent nieleczonych nicieni z TDP-43 było sparaliżowanych, w porównaniu z około 10 procent nicieni otrzymujących związek od wyklucia. Test funkcji synaptycznej wskazywał na podobny efekt: nicienie z TDP-43 były nadwrażliwe na aldikarb, lek służący do badania przekaźnictwa nerwowo-mięśniowego, a błękit metylenowy przesuwał ich odpowiedź w kierunku prawidłowej. Liczba degenerujących wypustek neuronów ruchowych malała, a najwyraźniejszy efekt występował przy 60 μM. U ryb znacznie poprawiło się pływanie wywołane dotykiem, a skrócone aksony ruchowe przy 30 lub 60 μM odrastały w kierunku prawidłowej długości, choć poprawa była częściowa, a nie pełna.

Dane dotyczące stresu oksydacyjnego są zgodne z interpretacją zakładającą działanie przeciwutleniające. U zmutowanych nicieni i ryb wskaźniki reaktywnych form tlenu były podwyższone i zmniejszały się po podaniu związku, a prawidłowe nicienie otrzymujące błękit metylenowy przeżywały obciążenie prooksydacyjne znacznie dłużej niż nieleczone. Istotne są jednak dwa ograniczenia. Całkowite poziomy zmutowanych białek TDP-43 i FUS nie zmniejszyły się, a w badaniu nie zmierzono bezpośrednio ilości agregatów białkowych. Wykazano więc poprawę funkcji, ale nie dowiedziono usuwania agregatów. Osoby śledzące sposób formułowania hipotez dotyczących procesów redoks i mitochondriów powinny uznać ten mechanizm za poparty danymi, lecz nie rozstrzygnięty.

Najbardziej pouczającym szczegółem był moment rozpoczęcia podawania związku. Gdy autorzy czekali do 5. dnia dorosłego życia, odsetek sparaliżowanych nicieni w 12. dniu wynosił około 55 procent, zamiast około 10 procent przy podawaniu od wyklucia. Ten sam lek, ten sam nicień, ta sama mutacja — znacznie mniejszy efekt. Duża część obserwowanej korzyści wynikała z wczesnej ekspozycji profilaktycznej.

Wynik zerowy: co wykazało badanie na myszach z SOD1

W badaniu na myszach z 2011 roku postawiono trudniejsze pytanie w bardziej rygorystycznym układzie badawczym. U kongenicznych myszy z SOD1 G93A choroba postępuje od drżenia kończyn tylnych, przez zaburzenia chodu i utratę odruchu prostowania, aż do z góry określonego końcowego punktu badania. Podawanie związku rozpoczęto przed wystąpieniem objawów, w 45. dniu życia, i kontynuowano codziennie, a obserwatorzy oceniali stan neurologiczny w skali od 0 do 6. Jest to eksperyment obejmujący cały przebieg choroby, więc dotyczy kwestii bliższych temu, co byłoby ważne dla pacjenta, niż jakakolwiek krzywa występowania paraliżu u nicieni.

Główne wyniki nie wykazały efektu. W całej grupie początek choroby następował po 121 dniach u zwierząt kontrolnych i po 124 dniach u zwierząt otrzymujących błękit metylenowy; różnica nie była istotna. Przeżycie do stadium końcowego wynosiło odpowiednio 167 dni i 170 dni, również bez istotnej różnicy. Kilka analiz drugorzędowych przemawiało na korzyść podawania związku: u samic początek choroby był opóźniony o około 7 dni, a zwierzęta otrzymujące związek spędzały nieco więcej czasu w łagodniejszych stadiach i mniej w ciężkich. Przy niewielkich podgrupach wyodrębnionych według płci i licznych porównaniach stadiów wyniki te należy traktować jako źródło hipotez, a nie dowód. Nie mierzono liczby neuronów, agregacji SOD1 ani markerów stresu oksydacyjnego czy zapalenia, więc badanie nie pozwala również stwierdzić, czy lek dotarł do swoich celów i nie zadziałał, czy przy tej dawce w ogóle na nie nie oddziaływał. Zbadano tylko jedną dawkę.

Sami autorzy wskazali najważniejsze ograniczenie, które działa w obie strony. Model SOD1 G93A z dużą liczbą kopii dobrze odtwarza chorobę związaną z toksycznością SOD1, ale stanowi ona niewielką część rodzinnych przypadków SLA, a jej biologia różni się od większości przypadków sporadycznych. Zasugerowali ponowne badanie kandydatów na leki w modelach ssaczych opartych na TDP-43. Od tego czasu ta sugestia stała się bardziej złożona, ponieważ autorzy badania na nicieniach i rybach zauważają, że w odrębnym badaniu błękitu metylenowego na myszach z TDP-43 również nie uzyskano poprawy sprawności ruchowej. Związek może więc wykazywać silny efekt w jednym układzie z TDP-43 i nie wykazywać go w innym układzie z TDP-43. Układ badawczy ma równie duże znaczenie jak gen.

Dlaczego poprawa u nicienia lub ryby nie dowodzi korzyści dla pacjentów

Warto myśleć o każdym modelu jako o odpowiedzi na inne pytanie.

Po pierwsze, różni się biologia. TDP-43 i FUS to białka wiążące kwasy nukleinowe, które w tych prostych układach wykazują wspólne interakcje genetyczne, natomiast toksyczność SOD1 wynika z częściowo odmiennych mechanizmów bezpośrednich. Lek łagodzący jeden rodzaj stresu proteotoksycznego nie musi łagodzić drugiego, a skuteczność wobec nadekspresji w zarodku nie musi przewidywać skuteczności wobec powolnej neurodegeneracji u dorosłego organizmu, której towarzyszą zapalenie, udział komórek glejowych i pogorszenie stanu całego organizmu.

Po drugie, różni się ekspozycja. Ciągła ekspozycja na związek w podłożu lub roztworze o stężeniu mikromolowym nie jest tym samym co podawanie doustne. Wchłanianie jelitowe, metabolizm pierwszego przejścia, wiązanie z białkami osocza, przenikanie do mózgu i eliminacja to procesy, które dzielą połkniętą dawkę od neuronu ruchowego rdzenia kręgowego. W żadnym z badań nie zmierzono stężenia leku w układzie nerwowym, więc nie można powiązać ekspozycji w jednym badaniu z ekspozycją w drugim.

Po trzecie, różni się moment rozpoczęcia podawania. Korzyści u nicieni i ryb w dużym stopniu zależały od rozpoczęcia podawania związku, zanim nagromadziły się zmiany patologiczne. U myszy podawanie również rozpoczęto przed wystąpieniem objawów, co jest mocną stroną badania, jednak u ludzi leczenie niemal zawsze zaczynałoby się po pojawieniu się objawów, czyli jeszcze później. Sygnał działania profilaktycznego w dwudniowym teście na zarodkach jest punktem wyjścia do badań, a nie modelem zastosowania klinicznego.

Po czwarte, różnią się punkty końcowe. Paraliż po 12 dniach, wrażliwość na aldikarb, długość aksonów w mikrometrach i dystans pływania to fenotypy bezpośrednio związane z badanym procesem. Początek choroby i przeżycie u ssaka odzwierciedlają łączne działanie wszystkich procesów kompensacyjnych i komplikujących w organizmie. Leki często zmieniają wskaźniki bezpośrednie bez wpływu na przeżycie, dlatego w badaniach na ssakach stosuje się punkty końcowe oparte na czasie do wystąpienia zdarzenia.

Czytelnicy, którzy chcą mieć listę pytań do oceny kolejnego nagłówka, mogą skorzystać z artykułu o tym, jak czytać badania przedkliniczne: jaki gatunek badano, jaki transgen zastosowano, jaka była dawka i droga podania, czy mierzono stężenia leku, kiedy rozpoczęto podawanie względem rozwoju zmian patologicznych, czy punkt końcowy dotyczył krótkotrwałego fenotypu czy przebiegu choroby oraz czy efekt odtworzono w drugim laboratorium. Szerszy zasób danych dotyczących błękitu metylenowego u ludzi pozostaje właściwym miejscem do sprawdzenia, czy którykolwiek z tych wczesnych sygnałów doczekał się potwierdzenia w danych klinicznych.

Co to oznacza dla pacjentów i rodzin

Z tych publikacji nie wynika żaden ustalony schemat stosowania błękitu metylenowego w SLA. Badanie z wynikiem pozytywnym uzasadnia dalsze prace nad mechanizmami oksydacyjnymi i synaptycznymi w biologii TDP-43 i FUS. Badanie z wynikiem zerowym przemawia przeciw oczekiwaniu wpływu na przebieg choroby typu SOD1 przy przewlekłym podawaniu doustnym i takiej ekspozycji. Razem opisują niespójność między modelami, a nie zalecenie leczenia.

Bezpieczeństwo wymaga tak samo wyważonego podejścia jak skuteczność. Badania SLA na myszach nie mówią nic o bezpiecznym dawkowaniu u ludzi, a błękit metylenowy wiąże się z rzeczywistym ryzykiem hemolizy przy niedoborze G6PD oraz toksyczności serotoninowej w połączeniu z lekami serotoninergicznymi. Podejrzenie niedoboru G6PD, przyjmowanie leków przeciwdepresyjnych i wszelkie planowane zmiany farmakoterapii to kwestie do omówienia z lekarzem. Przed podjęciem jakichkolwiek działań na podstawie nagłówków o wynikach laboratoryjnych należy również zapoznać się z ogólnymi danymi dotyczącymi bezpieczeństwa błękitu metylenowego.

Wniosek mieści się w jednym zdaniu. Błękit metylenowy przy wczesnej ekspozycji wyraźnie poprawiał badane fenotypy u nicieni i larw ryb z TDP-43 i FUS, a w badaniu na myszach z SOD1 przy przewlekłym podawaniu doustnym zasadniczo nie przyniósł korzyści w zakresie opóźnienia początku choroby ani przeżycia, więc rzetelna interpretacja wskazuje na dowody zależne od modelu, które nie uzasadniają stosowania u pacjentów.