Wie ontwikkelde de paarse bloedkleuring? Methyleenblauw, Malachowski, Romanowsky en Giemsa

Eosine is rood. Methyleenblauw is blauw. Meng de twee, breng het mengsel aan op een gedroogd bloeduitstrijkje en delen van het uitstrijkje kleuren paars.

Niet elk deel. In een goed preparaat worden de kernen van witte bloedcellen roodpaars, en binnen een malariaparasiet krijgt het chromatine dezelfde kleur, terwijl de omringende rode bloedcellen roze blijven en het cytoplasma grijsblauw blijft. Dankzij het paars zijn de celtypen van elkaar te onderscheiden.

Geen van beide flesjes bevat paars. De kleur ontstaat alleen wanneer een bepaald afbraakproduct van methyleenblauw op het objectglaasje met eosine in aanraking komt. In de jaren 1880 en 1890 wist niemand dat dit product bestond, laat staan wat het was. De mensen die naar de kleur zochten, werkten ieder voor zich met onzuivere kleurstoffen, zonder betrouwbare manier om te bepalen wat er in een flesje zat nadat het twee maanden op een plank had gestaan.

Daarom heeft de vraag in de titel meer dan één verdedigbaar antwoord, en daarom veranderde het antwoord in 2011.

Een resultaat dat met het mengsel veranderde

De kleuring werd niet uitgevonden. Ze ontstond stap voor stap. Elke verandering aan het mengsel leverde precies één nieuw stukje zichtbare informatie op, en de opeenvolging van die stukjes is de duidelijkste manier om de geschiedenis te begrijpen.

Het patroon in de laatste kolom is waar het om gaat. Elke vooruitgang verbreedde het kleurenpalet, en elke verbreding maakte weer een structuur zichtbaar. Het paars is geen versiering van de techniek; het maakt het verschil tussen zien dat er een parasiet aanwezig is en zien waaruit die bestaat. Hoe de kleurstof zelf vanuit een BASF-kleurstoffenfabriek in de geneeskunde terechtkwam, is een langere geschiedenis met eigen documenten. De volledige reeks hierboven, met de bron achter elke vermelding, is vastgelegd in een tijdlijn van bijdragen met bronverwijzingen.

Afbeelding: dezelfde zes mengsels, weergegeven als wat er in het schaaltje zat en wat eruit kwam. De cirkels tonen de kleurstoffen; de blokjes eronder tonen de kleuren die deze kleurstoffen in een bloeduitstrijkje konden opleveren. Vóór 1890 verschijnt nergens een roodpaars blokje, en daarna ontbreekt het nergens.

De man die bewust borax gebruikte

Ernst Malachowski was een arts in Breslau, het huidige Wrocław, die zijn loopbaan doorbracht in een privépraktijk en in een kleine kliniek die hij met een collega runde. Laboratoriumwerk deed hij in zijn eigen tijd. Hij werd op 12 maart 1857 geboren in Strzelno, studeerde geneeskunde aan de Universiteit van Breslau en werkte van 1882 tot 1887 als assistent in de interne geneeskunde in het Allerheiligenziekenhuis, destijds het op één na grootste ziekenhuis van Duitsland.

Hij begon in 1888 met de dubbele kleuring van Chęciński en Plehn. In een preparaat uit 1889 zag hij dat het chromatine van de plasmodiumkern anders kleurde dan het cytoplasma, maar vervolgens kon hij het resultaat niet reproduceren. Hij probeerde het methyleenblauw aan te zuren, wat de resultaten verslechterde. Hij probeerde het met borax alkalisch te maken, wat elke keer werkte. Hij demonstreerde de methode publiekelijk op 15 juni 1890 en publiceerde in augustus 1891 een uitgebreidere beschrijving, inclusief de instructie om borax te gebruiken. Hij merkte op dat de kleuring vierentwintig uur duurde en dat de resultaten gemakkelijk te reproduceren waren.

Vierentwintig uur is lang in een diagnostisch laboratorium, en zijn artikel ging niet uitvoerig in op de paarsrode kleur van de parasietkern. Wat de reden ook was, niemand pakte het bewust alkalisch maken van methyleenblauw op totdat Nocht het in 1898 opnieuw deed. Malachowski schreef nooit meer over bloedkleuring.

Dat er tot voor kort zo weinig over hem bekend was, heeft meer met archieven te maken dan met een mysterie. Er bleven nauwelijks sporen van zijn leven bewaard in de medische literatuur, en wat wel bewaard bleef, kwam via één route. Zijn dochter Marie verliet Duitsland in 1939 om naar Londen te gaan, diende in het Britse leger en vestigde zich in Canada. Haar verzameling familiepapieren belandde bij het Leo Baeck Institute in New York. Haar broer Leo sneuvelde in de Eerste Wereldoorlog. Haar zus Eva werd in april 1942 vanuit Breslau naar het doorgangskamp Izbica gedeporteerd en keerde nooit terug. Haar moeder Hedwig maakte op 22 april 1942 een einde aan haar leven in plaats van dezelfde deportatie af te wachten. Malachowski was in 1934 overleden, voordat dit alles gebeurde.

Een familiegeschiedenis die zo eindigt, is een familiegeschiedenis waarnaar niet meer wordt verwezen. De twee artikelen die Malachowski zijn plaats in de ontwikkeling van de kleuring teruggaven, beide gepubliceerd in 2011, werden samengesteld op basis van archiefstukken in Poznań en Wrocław en Maries papieren in New York.

Een beschimmeld flesje en een Rus met geluk

Dmitri Romanowsky studeerde geneeskunde aan de Militaire Medische Academie in Sint-Petersburg en werkte het grootste deel van zijn loopbaan aan malaria. In 1890 publiceerde hij een methode die op papier vrijwel identiek was aan die van Chęciński: ongewijzigd methyleenblauw en eosine, met iets meer eosine.

In september 1891 publiceerde hij de methode die hem beroemd maakte, en het cruciale detail zat verstopt in de instructies. Zijn beste resultaten kwamen van de voorradige methyleenoplossing, een voorraadoplossing van methyleenblauw die meer dan twee maanden had gestaan en waarop schimmel groeide. De schimmel en de tijd dat de oplossing had gestaan, hadden de kleurstof gedeeltelijk gedemethyleerd. Romanowsky wist dat niet en kon het niet beheersen, en andere onderzoekers die zijn methode probeerden, kregen het paars niet voor elkaar. Zijn proefschrift was in juni 1891 ingediend in Sint-Petersburg, en daarom wordt 1891 in de gangbare geschiedschrijving als het jaar van de ontdekking beschouwd.

Malachowski had zijn demonstratie in juni 1890 gegeven, ruim een jaar eerder, en zijn methode werkte door een bewuste ingreep.

Waarom de kleuring naar de verkeerde man werd vernoemd

De argumenten voor Malachowski werden bijeengebracht door Kristine Krafts, Ernst Hempelmann en Barbara Oleksyn en rusten op vier punten. De datum van de openbare demonstratie: juni 1890 tegenover september 1891. Het woord bewust tegenover het woord toevallig. Het feit dat Malachowski zijn methode publiceerde, inclusief borax, terwijl die van Romanowsky afhing van een ongecontroleerde variabele. En de constatering dat de beschrijving van de plasmodiumkern, samen met het paars dat die zichtbaar maakte, in feite zeven jaar lang uit de literatuur verdween, omdat niemand de toevallige versie kon reproduceren.

Ze zijn stellig in hun conclusie. In het biografische artikel noemen ze de toeschrijving "een aanfluiting", en ze citeren Ralph Lillie, die in 1978 schreef dat "we deze familie van kleuringen misschien Malachowski-kleuringen zouden moeten noemen".

De aanspraak wordt betwist, zoals meestal gebeurt bij aanspraken op voorrang, en het is zinvol om de aard van het geschil uit te leggen in plaats van het te beslechten. Een discussie over voorrang moet duidelijk maken wat de ontdekking was. Als de ontdekking de paarse kleur is, heeft Malachowski de vroegste gedocumenteerde demonstratie. Als de ontdekking de gepubliceerde methode is, publiceerden beide mannen in 1891 en werd de kleuring naar Romanowsky vernoemd. Als de ontdekking de verklaring is, kan geen van beiden aanspraak maken, omdat geen van beiden wist dat rijping demethylering was en geen van beiden kon zeggen waarom de kleur überhaupt ontstond. Dat laatste punt wordt in populaire beschrijvingen overgeslagen. Het werkzame bestanddeel was een onzuiverheid die niemand had geïdentificeerd, en de eerste persoon die de kleur bewust verkreeg, deed dat met een reproduceerbaar empirisch recept, niet vanuit inzicht in wat het recept deed.

De twee artikelen uit 2011 vormen de uitvoerigste gepubliceerde onderbouwing van de aanspraak van Malachowski, en beide zijn gratis te lezen via PubMed: het uitgebreide overzicht bij PMID 21235291 en het biografische artikel bij PMID 21660627. Het PubMed-record van het overzicht vermeldt ook een commentaar erop, dat later dat jaar in hetzelfde tijdschrift werd gepubliceerd op 86(5):366. Dat is een terechte herinnering dat het betoog meteen na verschijning ook in druk werd betwist.

Het geschil gaat niet over de chemie. Alle betrokkenen zijn het erover eens wat het paars is en welke componenten het veroorzaken. Het meningsverschil gaat over wie er het eerst kwam, en over de vraag of een toevalstreffer die niemand kon herhalen überhaupt als een geslaagde ontdekking telt.

Wat de latere namen opleverden

Als Malachowski het paars als eerste verkreeg, waarom draagt de kleuring dan de namen van Romanowsky, Wright en Giemsa?

Omdat een kleuring die één keer werkt in handen van de uitvinder nog geen reagens is. Het latere werk veranderde een grillig mengsel in iets dat een laborant in een ander land op een willekeurige dinsdag kon gebruiken.

Nocht kwam er door te redeneren. Nadat hij met een eenvoudige neutrale kleurstof geen betrouwbaar resultaat had verkregen, concludeerde hij dat het paars moest komen van iets in het methyleenblauw dat zelf geen methyleenblauw was, en ging hij daarnaar op zoek. Unna had al opgemerkt dat verouderde methyleenblauwoplossingen de granula van mestcellen rood kleurden, en stelde dat er tijdens het rijpen van de kleurstof een nieuwe stof ontstond. Bernthsen had in 1885 aangetoond dat alkalische omstandigheden methylgroepen van methyleenblauw afsplitsen, en dat deze producten de stoffen zijn die we nu azuren noemen. Nocht extraheerde de werkzame fractie met chloroform en kon die alleen rood uit methyleenblauw noemen; Michaelis gaf die in 1901 de naam azuur I. Jenner loste de logistiek op. Door het neerslag van methyleenblauw en eosine opnieuw op te lossen in absolute methanol ontstond één stabiele oplossing die het uitstrijkje tijdens het kleuren fixeerde en warmtefixatie overbodig maakte. Leishman en Reuter combineerden gepolychromeerde kleurstof met een alcoholisch oplosmiddel en verkregen zowel stabiliteit als het paars. Wright verving een incubatie van twaalf uur bij 65 °C en tien dagen staan door een uur in stromende stoom. Giemsa vertrouwde helemaal niet meer op een willekeurig gerijpte oplossing en gebruikte afgemeten hoeveelheden bekende kleurstoffen met glycerol in de methanol, zodat het product tropische hitte doorstond. Hij publiceerde nooit hoe hij zuiver methyleenazuur maakte. Hij verkocht het aan het laboratorium van Dr. Grübler in Leipzig, dat het als azuur I op de markt bracht en beweerde dat alleen zijn versie authentieke Giemsa-kleurstof was.

Over de identiteit van dat azuur wordt nog steeds gediscussieerd. Sommigen stellen dat het gewoon gepolychromeerd methyleenblauw was, anderen dat het rijk was aan Azure B. Het antwoord kwam voort uit een oorlog. Toen Duitse kleurstoffen niet meer verkrijgbaar waren, ontdekte een team van de United States Public Health Service, bestaande uit Ralph Lillie, Maurice Roe en Aimee Wilcox, dat de beste kleuring werd verkregen met drie gescheiden componenten: ongewijzigd methyleenblauw, het gedemethyleerde afbraakproduct Azure B en eosine. Azure B verving het niet-verkrijgbare azuur I, en die drie componenten vormen nog steeds de basis van de kleuring die tegenwoordig wordt gebruikt om malaria vast te stellen.

De chemie van de interactie tussen die drie componenten op een objectglaasje is een aparte vraag en het onderwerp van een andere pagina. De pagina over de rol van kleurstoffen en de chemie van Romanowsky-kleuringen behandelt wat Azure B en eosine elk doen en waarom het paar een kleur oplevert die geen van beide afzonderlijk produceert. De pagina over microscopie en laboratoriumtoepassingen behandelt de praktische kant: wat een bepaald preparaat laat zien en hoe je beoordeelt of een bepaald product geschikt is voor de methode die je wilt gebruiken.

Het deel van de geschiedenis dat nog steeds actueel is

Eén detail in dit verhaal bleef ook na 1902 waar. Ongeveer vijftig jaar lang was het belangrijkste bestanddeel van de wereldwijd gangbare malariakleuring een naamloze onzuiverheid. Die was er bij toeval, de hoeveelheid verschilde per flesje, de identiteit ervan was een deel van die tijd een handelsgeheim en over het aandeel werd tot in de jaren 1940 gediscussieerd. De mensen die de kleuring gebruikten, waren niet onzorgvuldig. Ze konden niet weten wat er in het flesje zat.

De moderne versie van hetzelfde probleem is een specificatie die maar een deel van het materiaal beschrijft. Voldoen aan de USP-norm is de route naar de hoogste zuiverheid die de markt biedt, omdat het een volledige gepubliceerde norm is in plaats van één enkele meting: identiteit, zuiverheid, organische onzuiverheden waaronder de azuurkleurstoffen, restoplosmiddelen, elementaire onzuiverheden, gloeirest, microbiologische grenswaarden en bacteriële endotoxinen. Blupreme betrekt zijn methyleenblauw van een farmaceutische fabrikant en publiceert het volledige analysecertificaat, zodat elke regel van die lijst kan worden gecontroleerd in plaats van alleen geclaimd. Een certificaat dat een resultaat voor zware metalen vermeldt en dat USP-conformiteit noemt, is het hedendaagse equivalent van een flesje met het etiket "gerijpt methyleenblauw": mogelijk een prima reagens, maar het etiket vertelt je niet wat erin zit.