Methyleenblauw en ontstekingssignalering: inflammasomen, IL-6 en STAT3

Stel dat drie laboratoria melden dat dezelfde blauwe verbinding ontstekingsremmend is. Het ene laat zien dat macrofagen minder IL-1beta afgeven. Het tweede laat minder iNOS-enzym zien in hetzelfde celtype. Het derde vindt minder IL-6 in het bloed en minder STAT3-activiteit in de hersenen. Het is verleidelijk om die drie resultaten samen te voegen tot één claim. Daarmee raakt de eigenlijke bevinding uit beeld.

Elk resultaat hoort bij een ander signaleringsmechanisme, met een eigen prikkel, assemblagestap en meetuitkomst. Methyleenblauw grijpt bij elk mechanisme op een ander punt aan. Of dit ook een gezondheidsuitkomst verbetert, is een afzonderlijke vraag die aan bod komt in ons overzicht van methyleenblauw en ontsteking. Deze pagina beperkt zich tot de signaleringsroutes.

Route 1: assemblage van inflammasomen en caspase-1

Een inflammasoom is een eiwitplatform dat naar behoefte in een myeloïde cel wordt opgebouwd. De onderdelen zijn een sensor, een adaptor genaamd ASC en een effectorenzym genaamd caspase-1. Na de assemblage knipt caspase-1 pro-IL-1beta en pro-IL-18 tot hun uitgescheiden vormen en kan het pyroptose activeren, een ontstekingsbevorderende vorm van celdood. De sensor bepaalt het type: NLRP3 reageert op kristallen en porievormende toxinen zoals nigericine en ATP, NLRC4 reageert op bacterieel flagelline, AIM2 reageert op dubbelstrengs DNA in het cytosol en de niet-canonieke route reageert op intracellulair lipopolysacharide.

Activering vereist twee signalen. Het eerste signaal is priming: een ligand van een Toll-like-receptor zet NF-kB-afhankelijke transcriptie van NLRP3 en pro-IL-1beta in gang, zodat de onderdelen beschikbaar zijn. Het tweede signaal is assemblage: een tweede prikkel zorgt ervoor dat ASC oligomeriseert tot zogeheten specks, caspase-1 wordt geknipt tot het p20-fragment en rijp IL-1beta p17 vrijkomt. Mitochondriale reactieve zuurstofsoorten en kristalopname zijn bekende factoren die bijdragen aan het tweede signaal voor NLRP3.

De macrofaagstudie uit 2017 naar brede remming van inflammasomen onderzocht methyleenblauw bij beide signalen. In beenmergmacrofagen van muizen die met lipopolysacharide waren geprimed, veroorzaakten nigericine, ATP en mononatriumuraatkristallen elk afgifte van IL-1beta en caspase-1 en vorming van ASC-specks. Methyleenblauw bij 20 tot 200 micromolar verminderde alle drie op dosisafhankelijke wijze, zonder de cellen te doden. Flagelline en Salmonella voor NLRC4, dubbelstrengs DNA en Listeria voor AIM2, en getransfecteerd lipopolysacharide of levende E. coli voor de niet-canonieke route vertoonden hetzelfde patroon. De verbinding alleen veroorzaakte geen afgifte en controleplaten lieten geen antibacterieel effect zien. Het resultaat betreft dus de respons van de gastheer.

Verder stroomopwaarts werden drie ingrepen gemeten. Door rotenon geïnduceerd mitochondriaal superoxide nam af met methyleenblauw, evenals de door rotenon aangedreven afgifte van IL-1beta. De opname van fluorescerende bolletjes nam af, wat past bij verminderde fagocytose vóór de detectie van kristallen. Een reporter die werd aangestuurd door de NLRP3-promotor met twee NF-kB-bindingsplaatsen vertoonde minder activiteit met methyleenblauw, terwijl een verkorte promotor zonder die plaatsen niet reageerde. In een celvrije reageerbuis verlaagde methyleenblauw ook rechtstreeks de activiteit van recombinant humaan caspase-1. Toevoeging van de verbinding uitsluitend tijdens priming of uitsluitend tijdens activering verminderde nog steeds de afgifte van IL-1beta, IL-18 en caspase-1. Beide stappen zijn dus betrokken.

De tests bij muizen kwamen overeen met deze selectiviteit. Een dodelijke dosis lipopolysacharide doodde de controledieren binnen enkele uren, terwijl methyleenblauw de overleving verbeterde; IL-1beta in het buikvliesvocht nam af, maar IL-6 in hetzelfde vocht niet. In een model van door Listeria veroorzaakte peritonitis nam IL-1beta in het buikvliesvocht af, terwijl de totale celaantallen onveranderd bleven. Humane THP-1-monocyten gedroegen zich bij alle vier de typen inflammasomen zoals muizenmacrofagen. Een resultaat voor inflammasomen verklaart de rijping van IL-1beta en IL-18, niet die van elke cytokine. Daarom beantwoordt ook de vorm van immuuncellen in de hersenen in experimenten met microglia en astrocyten een andere vraag dan de assemblage van het eiwitplatform.

Route 2: iNOS-transcriptie via binding van NF-kB en STAT1

Induceerbaar stikstofmonoxidesynthase, of iNOS, is in rust nauwelijks aanwezig en wordt naar behoefte getranscribeerd. Lipopolysacharide stimuleert dit voornamelijk via afbraak van IkB-alpha, gevolgd door fosforylering van NF-kB en verplaatsing ervan naar de celkern. Interferon-gamma stimuleert dit voornamelijk via fosforylering van STAT1 door Januskinase, gevolgd door verplaatsing van STAT1 naar de celkern. Elke factor bindt vervolgens aan zijn bindingsplaats op de iNOS-promotor. Enzymactiviteit en geninductie zijn afzonderlijke regulatiepunten, en een geneesmiddel kan op een van beide of op allebei aangrijpen.

De studie uit 2015 naar iNOS-inductie in macrofagen en endotoxemische muizen situeerde het effect op het niveau van het boodschapper-RNA. In RAW 264.7-cellen en primaire muizenmacrofagen verminderde 1 micromolar methyleenblauw, toegediend 30 minuten vóór lipopolysacharide, interferon-gamma of beide, het iNOS-eiwit en -mRNA gedurende 8 tot 24 uur. Daarbij was er minder nitriet in het medium en geen verlies van levensvatbaarheid. Bij muizen die 25 mg per kg lipopolysacharide kregen, verminderde een eenmalige dosis van 5 mg per kg, een uur eerder toegediend, het iNOS-eiwit en -mRNA in longen, lever en hart.

Het onderscheidende detail is wat niet veranderde. Afbraak van IkB-alpha, fosforylering van NF-kB, fosforylering van STAT1 en ophoping van beide factoren in de celkern bleven intact. De onderbreking trad één stap later op: kernextracten lieten minder binding van NF-kB aan zijn DNA-element zien na lipopolysacharide en minder binding van STAT1 na interferon-gamma. Chromatine-immunoprecipitatie bevestigde dat beide factoren binnen de cellen minder aanwezig waren op de iNOS-promotor. Tumornecrosefactor-alfa, waarvan de promotor eveneens NF-kB gebruikt, nam ook af. De factoren waren geactiveerd en op hun bestemming aangekomen, maar bonden slecht aan hun doel-DNA.

Let op het verschil met route 1. Dit betreft de binding van factoren aan DNA, gebruikt STAT1 in plaats van STAT3 en meet mRNA, eiwit en nitriet in plaats van ASC-specks en caspase-1-fragmenten. Ons overzicht van aangrijpingspunten van methyleenblauw in celmodellen houdt dit transcriptieniveau gescheiden van rechtstreekse enzymmetingen en mitochondriale metingen.

Route 3: serum-IL-6 en activering van STAT3 in weefsels

IL-6 geeft signalen via de gp130-receptorfamilie door aan de cascade van Januskinase naar STAT3. Gefosforyleerd STAT3 dimeriseert, gaat de celkern binnen en stuurt ontstekingsprogramma's aan. IL-6 zelf is een doelwit van NF-kB, waardoor de twee een terugkoppellus vormen die vaak de IL-6-STAT3-as wordt genoemd. De standaardmeetuitkomsten zijn serum-IL-6 stroomopwaarts, de verhouding tussen gefosforyleerd en totaal STAT3, en effectorenzymen zoals iNOS en COX2 stroomafwaarts.

De muizenstudie uit 2023 naar IL-6 en STAT3 na lipopolysacharide onderzocht deze as in verschillende compartimenten. Mannelijke C57BL/6-muizen kregen drie dagen lang dagelijks 1 mg per kg lipopolysacharide, met 5 of 10 mg per kg methyleenblauw 30 minuten na elke dosis. Op dag drie was serum-IL-6 in beide methyleenblauwgroepen lager dan bij alleen lipopolysacharide, terwijl de meeste andere cytokinen in het onderzochte panel niet veranderden door de behandeling. De verhoudingen tussen gefosforyleerd en totaal STAT3 waren lager in de cortex, hippocampus en oorhuid, met minder Iba-1-kleuring van microglia, minder iNOS en COX2 en gedeeltelijk verminderd gewichtsverlies.

Hier horen twee kanttekeningen bij. Lager serum-IL-6 in combinatie met minder STAT3-fosforylering in weefsels past bij modulatie van de as, maar maakt niet duidelijk wat het primaire aangrijpingspunt is. Minder cytokine stroomopwaarts, minder receptorsignalering of veranderde fosfataseactiviteit kunnen immers elk dezelfde verhouding opleveren. Bovendien is het gewicht gedurende drie dagen acute belasting een meetuitkomst voor het hele dier, geen symptoom- of remissiescore. Het biedt meer context dan een blot, zonder een signaleringsresultaat om te zetten in een behandelclaim. De afzonderlijke chemie van mitochondriale redoxprocessen loopt parallel aan dit verhaal over cytokinen en mag er niet mee worden samengevoegd.

Vergelijking van routes: aangrijpingspunten en meetuitkomsten

De tabel voorkomt drie ongeldige gevolgtrekkingen. Een resultaat voor ASC-specks bewijst geen resultaat voor STAT3. Een resultaat voor binding van STAT1 aan de iNOS-promotor bewijst geen resultaat voor STAT3, ook al behoren beide eiwitten tot de STAT-familie. Een resultaat voor serum-IL-6 bewijst geen verminderde assemblage van inflammasomen: in het peritoneale experiment nam IL-1beta af, maar IL-6 niet. Elke rij heeft zijn eigen prikkel en meetuitkomst nodig. Daarom vereist het lezen van cel-, dier- en klinische studies naar methyleenblauw dat elke claim wordt gekoppeld aan het niveau waarop daadwerkelijk is gemeten.

Niets hiervan stelt dosering, veiligheid of voordeel bij mensen vast. Lipopolysacharidemodellen zijn gecontroleerde prikkels om een mechanisme te onderzoeken, geen replica's van chronische ziekte. Toediening rond het moment van de prikkel onderzoekt het voorkomen van een geïnduceerde verandering, niet het terugdraaien van een al bestaande ziekte. Houd deze beschrijving van mechanismen gescheiden van patiëntuitkomsten en beoordeel elke gezondheidsclaim op basis van het patiëntenonderzoek dat eraan ten grondslag ligt.