Methyleenblauw en ALS: waarom resultaten tussen experimentele modellen verschillen

Wie zoekt op methyleenblauw en ALS, vindt twee beweringen die elkaar lijken tegen te spreken. De ene stelt dat de blauwe kleurstof neuronen beschermde in ALS-modellen. De andere stelt dat deze niets deed bij een ALS-muis. Beide beweringen verwijzen naar echte wetenschappelijke publicaties, en beide publicaties verdienen serieuze aandacht. De tegenspraak verdwijnt zodra je het uitgangspunt achter elk experiment benoemt: het model bepaalt de reikwijdte van de bewering.

Een resultaat bij een worm is een uitspraak over een worm. Een resultaat bij een vislarve is een uitspraak over een vislarve. Geen van beide is een uitspraak over een patiënt totdat onderzoek naar het ziekteverloop bij een zoogdier daar aanleiding toe geeft. Dit artikel vergelijkt de twee meest aangehaalde publicaties naast elkaar, zodat je kunt zien waarom hun antwoorden verschillen.

De twee experimenten in één tabel

Houd deze tabel erbij tijdens het lezen. Elk belangrijk verschil tussen de onderzoeken staat erin.

De genetica verschilt, de soorten verschillen, de toedieningsroute verschilt, het tijdstip verschilt en de eindpunten verschillen. Het genotype is slechts één van vijf verschillen. Deze twee onderzoeken kunnen dus niet bewijzen dat methyleenblauw selectief werkt op één ALS-mechanisme. Ze tonen iets beperkters aan dat nog steeds nuttig is: sterk herstel bij vroege, directe blootstelling in eenvoudige modellen vertaalde zich niet naar een ziekteverloop bij zoogdieren met langdurige orale toediening.

Het positieve resultaat: wat het onderzoek bij wormen en vissen liet zien

In het onderzoek uit 2012 bij wormen en vissen werd gemuteerd humaan TDP-43 of FUS tot expressie gebracht in motorneuronen van wormen en werd gemuteerd humaan mRNA in visembryo's geïnjecteerd. Dit zijn modellen voor proteotoxiciteit. Ze bootsen gedurende enkele dagen de toxische effecten van het gemuteerde eiwit op beweging en neuronvorm na, niet het volledige, jarenlange verloop van ALS bij volwassen mensen.

De behandeling begon zeer vroeg. Wormen groeiden vanaf het uitkomen op agar met methyleenblauw. Visembryo's verbleven gedurende één nacht in een oplossing met het middel, vanaf 24 uur na de bevruchting. Hun gedrag werd ongeveer twee dagen later getest. Er stond geen bloed-hersenbarrière tussen het middel en het neuron zoals bij een zoogdier, en er werden geen concentraties van het middel in plasma of hersenen gemeten.

Onder die omstandigheden waren de effecten groot en consistent. Zowel 6 als 60 μM verminderde leeftijdsafhankelijke verlamming bij TDP-43- en FUS-wormen. Op dag 12 van het volwassen stadium was ongeveer 80 procent van de onbehandelde TDP-43-wormen verlamd, tegenover ongeveer 10 procent van de wormen die vanaf het uitkomen waren behandeld. Een synaptische test wees in dezelfde richting: TDP-43-wormen waren overgevoelig voor aldicarb, een middel waarmee de neuromusculaire overdracht wordt onderzocht, en methyleenblauw verschoof de respons weer richting normaal. Het aantal degenererende motorneuronuitlopers daalde, met het duidelijkste effect bij 60 μM. Bij vissen verbeterde het door aanraking opgewekte zwemgedrag aanzienlijk en groeiden verkorte motorische axonen bij 30 of 60 μM weer richting hun normale lengte, al was het herstel gedeeltelijk en niet volledig.

De gegevens over oxidatieve stress passen bij een antioxidatieve verklaring. Gemuteerde wormen en vissen vertoonden verhoogde meetwaarden voor reactieve zuurstofverbindingen, die met de behandeling daalden. Normale wormen op methyleenblauw overleefden blootstelling aan een pro-oxidant veel langer dan onbehandelde wormen. Maar twee beperkingen zijn belangrijk. De totale hoeveelheden gemuteerd TDP-43- en FUS-eiwit daalden niet, en het onderzoek kwantificeerde eiwitaggregaten niet rechtstreeks. Het toont dus functioneel herstel aan zonder te bewijzen dat aggregaten werden verwijderd. Wie volgt hoe hypothesen over redoxprocessen en mitochondriën doorgaans worden geformuleerd, moet het mechanisme beschouwen als ondersteund, maar niet als vaststaand.

Het tijdstip was het meest leerzame detail. Toen de auteurs tot dag 5 van het volwassen stadium wachtten om de behandeling te starten, was op dag 12 ongeveer 55 procent verlamd, in plaats van ongeveer 10 procent bij behandeling vanaf het uitkomen. Hetzelfde middel, dezelfde worm, dezelfde mutatie, maar een veel kleiner effect. Vroege profylactische blootstelling verklaarde een groot deel van het ogenschijnlijke voordeel.

Het nulresultaat: wat het onderzoek bij SOD1-muizen liet zien

Het muizenonderzoek uit 2011 stelde een moeilijkere vraag in een strikter systeem. Bij congene SOD1 G93A-muizen verloopt de ziekte van tremor in de achterpoten via een verstoord looppatroon en verlies van de oprichtreflex naar een vooraf vastgesteld terminaal eindpunt. De behandeling begon vóór de symptomen op dag 45 en werd dagelijks voortgezet, waarbij waarnemers neurologische verschijnselen beoordeelden op een schaal van 0 tot 6. Dit is een experiment dat het volledige ziekteverloop bestrijkt. Daarmee staat het dichter bij wat voor een patiënt belangrijk is dan welke verlammingscurve bij een worm ook.

De belangrijkste uitkomsten lieten geen significant effect zien. De verschijnselen begonnen over het geheel genomen op 121 dagen bij de controlegroep, tegenover 124 dagen met methyleenblauw: een verschil dat niet significant was. De overleving tot het eindstadium was 167 dagen tegenover 170 dagen, eveneens niet significant. Enkele secundaire deelanalyses vielen gunstig uit voor de behandeling: bij vrouwtjes begonnen de verschijnselen ongeveer 7 dagen later, en behandelde dieren brachten iets meer tijd door in mildere stadia en minder in ernstige stadia. Met kleine subgroepen per geslacht en veel vergelijkingen tussen stadia zijn die deelanalyses eerder hypothesevormend dan bewijzend. Er werden geen neuronen geteld, geen SOD1-aggregatietest uitgevoerd en geen oxidatieve of ontstekingsmarkers gemeten. Het onderzoek kan dus ook niet aangeven of het middel zijn doelwitten bereikte en vervolgens niet werkte, of bij deze dosis eenvoudigweg nooit op die doelwitten inwerkte. Er werd slechts één dosis getest.

De auteurs wezen zelf op de meest fundamentele beperking, die in beide richtingen geldt. SOD1 G93A met een hoog kopieaantal modelleert ziekte door toxisch SOD1 goed, maar SOD1-gerelateerde ziekte vormt een klein deel van familiaire ALS en heeft een andere biologie dan de meeste sporadische ziektegevallen. Ze stelden voor kandidaatmiddelen opnieuw te testen in zoogdiermodellen op basis van TDP-43. Dat voorstel is sindsdien ingewikkelder geworden, omdat de auteurs van het wormen- en vissenonderzoek vermelden dat een afzonderlijk onderzoek naar methyleenblauw bij TDP-43-muizen evenmin de motorische uitkomsten verbeterde. Een verbinding kan dus sterk lijken in het ene TDP-43-systeem en geen effect laten zien in een ander TDP-43-systeem. Het systeem is even belangrijk als het gen.

Waarom verbetering bij een worm of vis geen voordeel voor patiënten kan aantonen

Beschouw elk model als een antwoord op een andere vraag.

Ten eerste verschilt de biologie. TDP-43 en FUS zijn nucleïnezuurbindende eiwitten met gedeelde genetische interacties in deze eenvoudige systemen, terwijl SOD1-toxiciteit via deels andere directe mechanismen verloopt. Een middel dat de ene vorm van proteotoxische stress vermindert, hoeft dat niet bij de andere te doen. Succes bij embryonale overexpressie hoeft evenmin succes te voorspellen bij langzame neurodegeneratie op volwassen leeftijd, met ontsteking, betrokkenheid van gliacellen en achteruitgang van het hele lichaam.

Ten tweede verschilt de blootstelling. Continue blootstelling via het medium bij micromolaire concentraties is niet hetzelfde als orale toediening. Absorptie in de darm, first-passmetabolisme, binding aan plasma-eiwitten, doordringing in de hersenen en klaring staan allemaal tussen een ingeslikte dosis en een motorneuron in het ruggenmerg. Geen van beide onderzoeken mat concentraties van het middel in het zenuwstelsel. Daardoor kan geen van beide zijn concentratie in verband brengen met die van het andere onderzoek.

Ten derde verschilt het tijdstip. De voordelen bij wormen en vissen hingen sterk af van behandeling voordat pathologische veranderingen zich opstapelden. Ook bij muizen begon de behandeling vóór de symptomen, wat een sterk punt is. Bij mensen zou de behandeling echter bijna altijd na het begin van de symptomen starten, dus nog later. Een profylactisch signaal in een embryotest van twee dagen is een startpunt voor onderzoek, geen model voor klinisch gebruik.

Ten vierde verschillen de eindpunten. Verlamming na 12 dagen, gevoeligheid voor aldicarb, axonlengte in micrometers en zwemafstand zijn proximale fenotypen. Het begin van verschijnselen en de overleving bij een zoogdier weerspiegelen alle compenserende en complicerende processen in het lichaam. Middelen veranderen regelmatig proximale meetwaarden zonder de overleving te veranderen. Daarom bestaan bij zoogdieren eindpunten die de tijd tot een gebeurtenis meten.

Lezers die een checklist voor de volgende nieuwskop willen, kunnen die ontlenen aan hoe je preklinische onderzoeken leest: vraag naar de soort, het transgen, de dosis en de toedieningsroute, of concentraties van het middel werden gemeten, wanneer de behandeling begon ten opzichte van de pathologie, of het eindpunt een kortetermijnfenotype of een ziekteverloop was, en of het effect in een tweede laboratorium werd gerepliceerd. De bredere bewijsbasis bij mensen voor methyleenblauw blijft de plek om na te gaan of een van deze vroege signalen zich heeft ontwikkeld tot klinische gegevens.

Wat dit betekent voor patiënten en families

Uit deze publicaties volgt geen vastgesteld protocol voor methyleenblauw bij ALS. Het positieve onderzoek ondersteunt verder onderzoek naar oxidatieve en synaptische mechanismen in de biologie van TDP-43 en FUS. Het nulresultaat pleit tegen de verwachting dat langdurige orale toediening bij deze blootstelling het ziekteverloop van SOD1-gerelateerde ziekte zal veranderen. Samen beschrijven ze inconsistente resultaten tussen modellen, geen behandelaanbeveling.

Veiligheid verdient dezelfde nuchtere benadering als werkzaamheid. ALS-onderzoeken bij muizen zeggen niets over veilige dosering bij mensen. Methyleenblauw brengt reële risico's met zich mee door hemolyse bij G6PD-deficiëntie en door serotoninetoxiciteit in combinatie met serotonerge geneesmiddelen. Een vermoeden van G6PD-deficiëntie, huidig gebruik van antidepressiva en elke voorgenomen wijziging in medicatie horen thuis in een gesprek met een arts. Dat geldt ook voor het doornemen van algemene veiligheidsgegevens over methyleenblauw voordat iemand handelt op basis van nieuws over laboratoriumonderzoek.

De kern past in één zin. Methyleenblauw zorgde bij vroege blootstelling voor sterk herstel van fenotypen bij TDP-43- en FUS-wormen en -vislarven, maar had in een onderzoek met langdurige orale toediening bij SOD1-muizen vrijwel geen voordeel voor het begin van verschijnselen of de overleving. De eerlijke interpretatie is daarom modelafhankelijk bewijs dat gebruik bij patiënten niet ondersteunt.