E. coli en andere kolonievormen op EMB-agar beoordelen

Een student strijkt een onbekend organisme uit op eosine-methyleenblauwagar, incubeert de plaat een nacht en ziet daarna donkere kolonies met een groene glans. In het labjournaal staat: "E. coli, bevestigd." Die notitie beweert meer dan de plaat kan onderbouwen. De plaat toont een groei- en fermentatiefenotype onder specifieke omstandigheden. De soortidentiteit is een afzonderlijke conclusie waarvoor afzonderlijk bewijs nodig is.

Deze gids behandelt EMB-agarresultaten als een interpretatievraagstuk. Hij legt het achterliggende principe uit, doorloopt een illustratieve platenatlas met controles en benoemt de gevallen waarin het leerboekbeeld misleidend is.

Het principe achter de plaat

EMB-agar is zowel selectief als differentieel. De kleurstoffen eosine Y en methyleenblauw remmen veel grampositieve organismen, waardoor het medium de groei van gramnegatieve organismen bevordert. Dezelfde kleurstoffen werken als indicatoren: wanneer een organisme de beschikbare suiker fermenteert en plaatselijk voldoende zuur produceert, neemt de kolonie veel kleurstof op en wordt deze donkerpaars tot blauwzwart. Bij sterke zuurproductie kan het kolonieoppervlak een metaalgroene irisatie vertonen. Het ASM-protocol voor eosine-methyleenblauwagарplaten beschrijft deze combinatie van selectie en differentiatie en biedt referentiefoto's voor het onderwijs.

Eén detail is belangrijk voordat je een resultaat beoordeelt: controleer welke samenstelling wordt gebruikt. De oudere Holt Harris Teague-samenstelling bevat lactose en sacharose, terwijl Levine EMB alleen lactose bevat. Een organisme dat sacharose maar geen lactose fermenteert, zoals veel isolaten van Serratia marcescens, kan er op de twee varianten verschillend uitzien. De fabrikantdocumentatie voor EMB-media vermeldt dit verschil in samenstelling expliciet. Noteer de fabrikant en samenstelling samen met het resultaat in het labjournaal.

Bereide, niet-geënte EMB-agar is doorgaans roodbruin tot roodpaars, soms met een groenachtige tint of fijn neerslag. Die achtergrondkleur is geen groei. Vergelijk elke beoordeling met een niet-geënte plaat of de gedocumenteerde uitgangstoestand en beoordeel de primaire plaat na ongeveer 18 tot 24 uur aerobe incubatie bij 35 tot 37 C, tenzij het onderwijsprotocol anders voorschrijft. Langere incubatie kan het uiterlijk van de fermentatiereactie veranderen.

Hoe je de plaat bekijkt

Gebruik twee soorten licht. Bekijk de plaat eerst bij gereflecteerd of schuin invallend licht en kantel deze: de metaalglans is iriserend en kan afhankelijk van de kijkhoek verschijnen of verdwijnen. Onderzoek de plaat vervolgens met doorvallend licht om de koloniekleur en donkere centra te beoordelen. Gebruik goed geïsoleerde kolonies, omdat dicht opeenliggende en naburige kolonies de plaatselijke zuurophoping beïnvloeden en de kleur kunnen verzwakken of versterken. De ASM-afbeeldingenreeks laat dit rechtstreeks zien: E. coli in een mengcultuur kan zijn verwachte glans verliezen doordat omliggende organismen de zuuromstandigheden veranderen.

Neem controles op wanneer de oefening dat toelaat. Een gebruikelijke onderwijsset bestaat uit E. coli ATCC 25922 voor het blauwzwarte fenotype met metaalglans, een niet-fermenterend organisme zoals Salmonella Typhimurium ATCC 14028 of Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 voor het kleurloze fenotype, en een grampositief organisme zoals Enterococcus faecalis of Staphylococcus aureus als remmingscontrole, zoals vermeld in standaardtabellen voor kwaliteitscontrole van EMB-media. Als de positieve controle geen glans vertoont, denk dan eerst aan incubatie, te dicht opeenliggende kolonies of de samenstelling voordat je het onbekende organisme in twijfel trekt.

Illustratieve platenatlas

De onderstaande platen zijn gegenereerde illustraties, geen foto's van echte culturen. Ze tonen het patroon waarop je moet letten, niet de exacte tint van een afzonderlijke stam. Vergelijk ze met de ASM-referentiefoto's en met echte platen uit het onderwijslaboratorium.

Plaat 1: Escherichia coli op EMB-agar, sterke lactosefermenteerder

E. coli op EMB-agar is doorgaans donkerpaars tot blauwzwart, vaak met een donker centrum en een metaalgroene glans door sterke zuurproductie. De glans is de bekende bevinding waar studenten naar zoeken, maar beschouw deze als ondersteunend bewijs en niet als een definitie. De intensiteit van de glans varieert met de stam, incubatietijd, koloniedichtheid en kijkhoek. Afwezigheid van glans sluit E. coli niet uit, en een donkere kolonie zonder glans kan op verschillende andere fermenteerders wijzen. Kies voor vervolgonderzoek een goed geïsoleerde kolonie in plaats van een dichtbegroeide sector te beoordelen.

Plaat 2: Klebsiella pneumoniae op EMB-agar, slijmerige fermenteerder

Klebsiella pneumoniae vormt op EMB-agar doorgaans grote, glanzende, slijmerige kolonies in rozepaarse tot bruinpaarse tinten, vaak met donkere centra maar meestal zonder sterke metaalglans. Een vergelijkbare morfologie komt voor bij verwante fermenteerders zoals Enterobacter. De slijmerige textuur en koloniegrootte maken deel uit van de beoordeling: een kleine, platte roze kolonie weegt anders mee dan een grote, bolle, slijmerige kolonie. Net als bij E. coli wijst de plaat op een fermentatiefenotype; een soortnaam toekennen vereist de hieronder beschreven biochemische bevestiging.

Plaat 3: Salmonella op EMB-agar en andere niet-fermenterende organismen, kleurloze kolonies

Salmonella op EMB-agar en verwante organismen die geen lactose fermenteren, waaronder Shigella en veel Pseudomonas-isolaten, groeien doorgaans als kleurloze tot doorschijnende of licht amberkleurige kolonies. Sommige samenstellingen en omstandigheden geven een zwakke roze tint, dus een lichtroze kolonie is niet automatisch een fermenteerder. EMB onderscheidt Salmonella niet van Shigella of van andere niet-fermenterende organismen; dat onderscheid wordt met latere tests gemaakt. Let er ook op dat lactosepositieve Salmonella-stammen met metaalglanzende kolonies die op E. coli lijken, zijn gedocumenteerd. Dat is nog een reden waarom één plaat geen definitief uitsluitsel kan geven.

Plaat 4: Serratia marcescens en de valkuil van de samenstelling

Serratia marcescens verdient een eigen onderdeel, omdat studenten vaak rode kolonies verwachten en de plaat vervolgens verkeerd interpreteren. De meeste klinische isolaten fermenteren geen lactose en zien er op Levine EMB daarom meestal bleek tot zwak gekleurd uit. Omdat veel isolaten sacharose fermenteren, kan een samenstelling met sacharose een donkerdere of duidelijker met zuur samenhangende reactie geven. Verwacht bij 35 tot 37 C ook niet het klassieke rode prodigiosinepigment; pigmentproductie is onbetrouwbaar bij de incubatortemperatuur. Wanneer het protocol Serratia marcescens op EMB-agar noemt, controleer dan van welke samenstelling die uitspraak uitgaat. Een overzicht van het metabolisme van Serratia vat het lactosenegatieve en voor sacharose variabele patroon achter deze valkuil samen.

Plaat 5: controles en geremde organismen

Grampositieve organismen zoals Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus en Bacillus worden op EMB-agar doorgaans geremd of sterk onderdrukt, al is de remming niet voor elke stam absoluut. Een controlepanel zorgt voor een betrouwbare beoordeling: de E. coli-controle moet goede groei met een blauwzwarte kleur en glans vertonen, de controle met een niet-fermenterend organisme moet kleurloze groei vertonen en de remmingscontrole moet weinig of geen groei vertonen. Als de remmingscontrole goed groeit, is de selectieve werking tekortgeschoten en is elke andere beoordeling van die partij twijfelachtig. Kleuringsmethoden beantwoorden een andere vraag dan kweekmedia; zie voor het kleuren van preparaten in het laboratorium de atlas van methyleenblauwkleuring.

Vergelijking met duidelijke grenzen

Drie zinnen vatten de misleidende verschijningsvormen samen. Donker betekent niet E. coli, want Klebsiella, Enterobacter en andere fermenteerders ontwikkelen donkere centra zonder glans. Roze betekent niet Klebsiella, want matige of langzame fermenteerders en sommige organismen die als niet-fermenterend gelden, zien er roze of lavendelkleurig uit. Glans betekent niet definitief E. coli, want andere sterke fermenteerders kunnen deze ook produceren. Het onderwijsprotocol en de afbeeldingen van mengculturen daarin illustreren elk van deze valkuilen.

Grenzen aan bevestiging

EMB-agar toont een fenotype, geen soort. Verschillende organismen kunnen hetzelfde koloniebeeld hebben, en één organisme kan door stamverschillen, leeftijd, dicht opeenliggende kolonies, samenstelling en incubatie afwijken van het leerboekbeeld. Daarom wordt EMB-morfologie in onderwijs- en klinische werkprocessen als voorlopig beschouwd.

Een verantwoorde werkwijze voor studenten is: beschrijf de geïsoleerde kolonie (grootte, kleur, centrum, glans bij schuin invallend licht, slijmerig karakter), noteer de samenstelling, incubatietijd en temperatuur, en de controles; kweek vervolgens een goed geïsoleerde kolonie over tot een zuivere cultuur voordat je een bevestigingstest uitvoert. Gebruikelijk vervolgonderzoek omvat een gramkleuring plus IMViC-reacties voor voorlopige identificatie van E. coli en coliformen, TSI of KIA en organismespecifieke biochemische panels voor enterische organismen, met serologische identificatie, MALDI TOF of andere gevalideerde identificatiemethoden wanneer de opdracht dat vereist. Raadpleeg voor achtergrond over de plaats van EMB binnen selectieve en differentiële enterische media inleidingen op enterische kweekmedia en vervolgonderzoek met gramkleuring. Voor de verwante vraag wat een blauwe preparaatkleuring wel en niet kan aantonen, houdt de atlas van methyleenblauwkleuring waarneming en conclusie op dezelfde manier gescheiden.

Schrijf de waarneming vóór de conclusie. "Donkere blauwzwarte kolonies met kijkhoekafhankelijke groene glans op Levine EMB na 24 uur, passend bij sterke lactosefermentatie" is verdedigbaar. "E. coli, bevestigd" vereist de bevestigingsstap die de plaat alleen niet kan leveren.