लेख
मेथिलिन ब्लु कोशिकामा कसरी प्रवेश गर्छ: अपचयन, पुनः अक्सिकरण र झिल्लीमा विभाजन
एन्डोथेलियल कोशिकाहरू राखिएको पात्रमा मेथिलिन ब्लु ग्रहण भएको हेर्दा सहजै निकालिने निष्कर्ष नै गलत हुन्छ। माध्यमको नीलो रङ हराउँछ र कोशिकाहरूमा नीला कणहरू देखिन्छन्, त्यसैले रञ्जक नीलो अणुकै रूपमा झिल्ली पार गरेर गएको हुनुपर्छ भन्ने लाग्छ। प्रयोगहरूले भने अर्कै कुरा देखाउँछन्। नीलो रूप झिल्ली पार गरेर बिरलै जान्छ। पार गर्ने रूप रङहीन हुन्छ, र भित्र देखिने नीलो रूप त्यहाँ पुगेपछि भित्रै बन्छ।
यो उल्टो प्रक्रिया महत्त्वपूर्ण छ, किनभने यसैले रङ लाग्नुबाट के थाहा पाउन सकिन्छ र के सकिँदैन भन्ने निर्धारण गर्छ। नीला कणहरूले कोशिकाङ्गहरूमा पुनः अक्सिकृत भएर थुनिएको अक्सिकृत रञ्जक जनाउँछन्। तिनले कोशिकामा भएको कुल रञ्जक जनाउँदैनन्, अपचयित रूपको सञ्चिति जनाउँदैनन् र जैविक प्रभाव मापन गर्दैनन्। किन यस्तो हुन्छ भनेर बुझ्न तीन चरण पछ्याउनुहोस्: सतहमा अपचयन, अपचयित रूपको प्रसरण, अनि भित्र पुनः अक्सिकरण र थुनिने प्रक्रिया।
दुई रूपको व्यवहार फरक अणुहरूको जस्तै हुन्छ
अक्सिकृत मेथिलिन ब्लु समतल, धनात्मक आवेश भएको वलय संरचना हो। यो पानीमा घुल्छ, करिब 600 देखि 700 nanometers क्षेत्रमा प्रकाश तीव्र रूपमा अवशोषण गर्छ र नीलो देखिन्छ। यहाँ मुख्य कुरा आवेश हो। आवेशयुक्त, पानीप्रेमी अणु लिपिड झिल्लीबाट सजिलै छिर्दैन, त्यसैले वैज्ञानिक साहित्यमा सावधानीपूर्वक प्रयोग हुने अभिव्यक्ति झिल्लीका लागि तुलनात्मक रूपमा अपारगम्य हो, पूर्णतः अपारगम्य होइन।
अपचयित मेथिलिन ब्लुलाई ल्युक मेथिलिन ब्लु भनिन्छ। यो रङहीन, आवेशरहित र बोसोमा घुलनशील हुन्छ। आवेश हटेपछि झिल्ली अब पर्खालजस्तो अवरोध रहँदैन। अपचयित अणु सजिलै झिल्ली पार गरेर प्रसरण गर्छ, र बढी अक्सिकरणकारी खण्डमा पुगेपछि यसले फेरि इलेक्ट्रोन गुमाएर नीलो, आवेशयुक्त र थुनिने रूप लिन सक्छ। त्यसैले रञ्जकको रेडक्स रसायन नै यसको परिवहन संयन्त्र पनि हो। इलेक्ट्रोनको संख्या परिवर्तन गर्दा पारगम्यता पनि परिवर्तन हुन्छ।
पहिलो चरणका इलेक्ट्रोन कोशिकाबाटै आउँछन्। स्तनधारीका कोशिकाहरूले प्लाज्मा झिल्ली पार इलेक्ट्रोन परिवहन गर्छन्, जसमा कोशिकाभित्रका दाताबाट अपचायक समतुल्यहरू बाहिरी सतहका स्वीकारकर्तातर्फ सारिन्छन्। प्लाज्मा झिल्ली पार हुने यो गतिविधि सामान्य कोशिकीय कार्य हो र धेरैजसो कोशिका प्रकारमा पाइन्छ। थायाजिन रञ्जकहरूमा काम गर्ने एन्डोथेलियल सतहको रिडक्टेजले एउटा महत्त्वपूर्ण पक्षमा अन्य रिडक्टेजजस्तै व्यवहार गर्छ: पछिल्ला चरणहरू रोक्ने मात्रामा साइनाइड र एजाइड उपस्थित हुँदा पनि यसले काम गरिरहन्छ। यही पृथक्करण सम्पूर्ण व्याख्याको निर्णायक बिन्दु हो।
विभाजनको अवधारणा पहिले आयो, र यसले ग्रहणलाई लगभग व्याख्या गर्यो
1929 मा रकफेलर इन्स्टिच्युटकी मेरियन इरविनले अझ सरल प्रश्न सोधिन्। सम्भवतः रञ्जकको प्रवेश भनेको पानी र कोशिकाका बोसोयुक्त तहहरूबीचको विभाजन मात्र हो, र प्रयोगशालामा क्लोरोफर्मको तहले ती बोसोयुक्त तहहरूको प्रतिनिधित्व गर्न सक्छ। उनका स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक प्रवेश अध्ययनहरूले जलीय रञ्जक घोलहरूलाई क्लोरोफर्मसँग हल्लाएर जैविक चरणमा सरेको पदार्थलाई जीवित शैवाल कोशिकाहरूमा प्रवेश गरेको पदार्थसँग तुलना गरे।
त्यस कामका दुई निष्कर्ष अझै ध्यान दिन योग्य छन्। पहिलो, व्यावसायिक मेथिलिन ब्लु घोलहरूमा ट्राइमेथिल थायोनिन थियो, जसलाई अहिले azure B भनिन्छ। यो अशुद्धि मेथिलिन ब्लुभन्दा छिटो प्रवेश गर्थ्यो, विशेष गरी क्षारीय pH मा, जहाँ लिपिडमा घुलनशील मुक्त क्षार रूपको प्रभुत्व हुन्छ। मेथिलिन ब्लुको प्रवेशजस्तो देखिएको केही भाग वास्तवमा azure B को चयनात्मक प्रवेश थियो। दोस्रो, pH ले आयनीकरणको अवस्था निर्धारण गरेर परिणाम तय गर्थ्यो, र क्षतिग्रस्त कोशिकाहरूमा अक्षत कोशिकाहरूभन्दा धेरै रञ्जक प्रवेश गर्थ्यो। विभाजन गुणाङ्क र आवेशको अवस्थाले कृत्रिम प्रणाली र जीवित कोशिकाले के अवशोषण गर्छन् भन्ने निर्धारण गर्थे। यी दुईबीचको समानताले कोशिकाको सीमामा गैरजलीय तहहरू हुन्छन् भन्ने अवधारणालाई समर्थन गर्यो।
यो मोडेल लिपिड र आयनीकरणबारे दूरदर्शी थियो, तर यसले आफ्नै रूपमा विभाजित हुने रञ्जक र सतहमा रासायनिक रूपान्तरण भएर अर्को रूपमा झिल्ली पार गर्ने तथा भित्र फेरि पुरानै रूपमा फर्किने रञ्जकबीच भेद गर्न सकेन। त्यो भेद छुट्याउन फरक प्रयोग चाहिन्थ्यो, जुन सत्तरी वर्षपछि फोक्सोको एन्डोथेलियममा गरियो।
बाहिर अपचयन, भित्र थुनिने प्रक्रिया
मर्कर र सहकर्मीहरूले संवर्धित गाईको फोक्सोको धमनीका एन्डोथेलियल कोशिकाहरूमा काम गरे र तीन चरणको क्रम प्रस्ताव गरे: अक्सिकृत रञ्जक कोशिकाको सतहमा अपचयित भएर आफ्नो रङहीन लिपिडप्रेमी रूप लिन्छ, अपचयित रूप प्रसरण भएर भित्र प्रवेश गर्छ, र कोशिकाभित्र पुनः अक्सिकरण हुँदा झिल्लीका लागि अपारगम्य अक्सिकृत रूप फेरि बनेर जम्मा हुन्छ। त्यसपछि उनीहरूको एन्डोथेलियल थायाजिन ग्रहण अध्ययनले यस क्रमका निश्चित बिन्दुहरू अवरुद्ध गर्ने प्रयास गरेर यसको परीक्षण गर्यो।
पहिलो साधन फेरिसाइनाइड थियो, जुन कोशिकाभित्र प्रवेश गर्न नसक्ने इलेक्ट्रोन स्वीकारकर्ता हो। सतहका इन्जाइमहरूले कोशिकाबाहिर नीलो रञ्जकलाई रङहीन रूपमा अपचयित गर्दा फेरिसाइनाइडले ती इलेक्ट्रोन फेरि खोसेर रञ्जक झिल्ली पार गर्नुअघि नै माध्यममा नीलो रञ्जक पुनः बनाउन सक्छ। फेरिसाइनाइड अधिक मात्रामा रहुन्जेल (10 micromolar रञ्जकको तुलनामा 50 देखि 500 micromolar फेरिसाइनाइड), रञ्जकको ग्रहण लगभग रोकियो। फेरिसाइनाइड खपत भएपछि मात्र ग्रहण सामान्य दरमा फेरि सुरु भयो। गतिसम्बन्धी तथ्याङ्कले पनि अर्को तरिकाले यही कुरा देखायो। फेरिसाइनाइड लगभग स्थिर दरमा हरायो, जुन पुनः चक्रित हुन सक्ने मध्यस्थलाई निरन्तर आपूर्ति गर्ने सतही अपचयन प्रवाहसँग मेल खान्थ्यो। अर्कोतर्फ, कोशिकाबाहिरको रञ्जकको सञ्चिति घट्दै जाँदा त्यो घाताङ्कीय रूपमा हरायो। स्थिर प्रवाह र घट्दो सञ्चितिले फेरिसाइनाइडको सङ्केतले निरन्तर अपचयन जनाउँछ, रञ्जकका अणुहरू घोलबाट बाहिरिएको होइन भन्ने देखाउँछन्।
दोस्रो साधनले झिल्ली पार गर्ने चरण नै हटायो। टोलीले थायाजिनको नजिकको सम्बन्धित रञ्जक टोलुइडिन ब्लु O लाई ठूलो पोलिएक्रिलामाइड शृङ्खलासँग जोड्यो। त्यो शृङ्खला दुवै अक्सिकरण अवस्थामध्ये कुनैमा पनि कोशिकाभित्र प्रवेश गर्न नसक्ने गरी ठूलो थियो। कोशिकाहरूले त्यसरी बाँधिएको रञ्जकलाई पनि अपचयित गरे। त्यसैले अपचयनका लागि कोशिकाभित्र पहुँच आवश्यक छैन। यो संयन्त्र सतहमा खुला रूपमा अवस्थित छ वा सतहसँग विद्युतीय रूपमा जोडिएको छ।
त्यसपछि अध्ययनपत्रलाई आफ्नो शीर्षक दिने पृथक्करण आयो। 2 millimolar मा साइनाइड र एजाइडले रञ्जकको सञ्चयलाई निकै दबाए। सूक्ष्मदर्शीमा हेर्दा सामान्यतया केन्द्रक वरिपरि घेरा बनाउने गाढा नीला र बैजनी अन्तःसमावेशहरू लगभग हराए। तर कुनै पनि अवरोधकले कोशिकाबाहिरको अपचयन सुस्त पारेन: फेरिसाइनाइडको चक्रण उस्तै चलिरह्यो र झिल्ली पार नगर्ने पोलिमर पनि अपचयित भइरह्यो। अवरोध त्यसपछिको चरणमा थियो। साइनाइड र एजाइडले सतही अपचयन होइन, कोशिकाभित्रको पुनः अक्सिकरण र अलग राखिने प्रक्रियालाई रोकिरहेका थिए। कोशिकाको जीवित अवस्था जाँच्ने नियन्त्रणहरूले पनि यो व्याख्यालाई समर्थन गरे, किनभने यी उपचारका क्रममा कोशिकाहरूले आफ्नो साइटोसोलको सूचक इन्जाइम ल्याक्टेट डिहाइड्रोजनेज जोगाइराखे। त्यसैले ग्रहण घट्नु केवल विषाक्तता वा झिल्ली फुट्नुको परिणाम थिएन।
अध्ययनपत्रको एउटा सावधानी अझै लागू हुन्छ। नीला अन्तःसमावेशहरू केन्द्रक वरिपरि थिए, तर केन्द्रकभित्र थिएनन्। यो कोशिकाङ्गहरूभित्र अक्सिकरण हुने कुरासँग मेल खान्थ्यो, तर अध्ययनले कुन कोशिकाङ्ग हुन् भनेर पहिचान गरेन। अन्य कोशिका प्रकारमा देखिएका उस्तै ढाँचालाई कमजोर प्रमाणका आधारमा लाइसोसोमसम्बन्धी भनिएको थियो। थुनिने प्रक्रियालाई स्थापित तथ्य र त्यसको स्थानलाई अस्थायी निष्कर्ष मान्नुहोस्। इलेक्ट्रोन त्यसपछि कहाँ जान्छन् भनेर बुझ्न चाहने पाठकहरूले माइटोकन्ड्रियाको इलेक्ट्रोन परिवहन र रेडक्स व्यवस्थापन तथा प्रवेश मार्गअनुसार अवशोषण र वितरण को विस्तृत विवरण पढ्न सक्छन्।
रङ लाग्नु भनेको सम्पर्कमा आएको मात्रा होइन
तेस्रो अध्ययनले यो ग्रहण प्रक्रियालाई जैविक मापनसँग जोड्दा के हुन्छ भन्ने देखाउँछ। स्कट र सहकर्मीहरूले वलयाकार चिनीको संरचना मिथाइल बिटा साइक्लोडेक्स्ट्रिन मेथिलिन ब्लुसँग सीधै बाँधिन्छ भन्ने पत्ता लगाए। अन्तःसमावेशन सङ्कुलका लागि यसको साहचर्य स्थिराङ्क करिब 310 per molar थियो, जबकि रञ्जकको द्विअणुकरणका लागि करिब 5846 per molar थियो। L929 फाइब्रोब्लास्टहरूमा यस बन्धनले कोशिकामा रङ लाग्न र ग्लुकोज ग्रहणको उत्तेजना दुवैलाई रोक्यो: साइक्लोडेक्स्ट्रिनसँग पहिले इन्क्युबेसन गर्दा नीलो रङ लाग्न पाएन, र पछि थप्दा रङ हट्ने गति बढ्यो। प्रकाशीय नीलो सङ्केत कोशिकाबाट हराउँदै जाँदा सक्रिय भएको ग्लुकोज परिवहन पनि निकट समानान्तर रूपमा घट्यो।
लेखकहरूले यो सहसम्बन्धलाई दीर्घकालीन अक्सिडेटिभ तनाव संयन्त्रभन्दा रञ्जक र ग्लुकोज परिवाहक सक्रिय हुने मार्गको कुनै प्रोटिनबीच प्रत्यक्ष अन्तरक्रियाको पक्षमा रहेको माने। यो निष्कर्ष उचित छ, तर यसको सीमा छ। प्रयोगले प्रोटिनको नाम पहिचान गर्दैन, परिवाहकसँगै प्रत्यक्ष बन्धन भएको देखाउँदैन, र रङ हट्नु तथा प्रभाव हराउनुबीचको सहसम्बन्धले रेडक्सद्वारा मध्यस्थता हुने सबै मार्गलाई नकार्न सक्दैन।
यहाँको स्थायी पाठ मापनसँग सम्बन्धित छ। प्रकाशीय रङले देख्न सकिने, अक्सिकृत र कोशिकासँग सम्बन्धित रञ्जक जनाउँछ। यसले रङहीन अपचयित सञ्चितिलाई पूरै छुटाउँछ, त्यसैले फिका कोशिकामा पनि रञ्जकका समतुल्यहरू हुन सक्छन्। त्यस्तै, गाढा रङ लागेको कोशिकाले थुनिएको अक्सिकृत रञ्जक जनाउँछ, तन्तुमा पुगेको कुल मात्रा वा प्रभावको परिमाण होइन। यही सावधानी ठूलो स्तरमा पनि लागू हुन्छ: विभिन्न कोशिका प्रकारबीच रङको तुलना गर्नु वा गाढा रङ लागेको तन्तुको काटिएको भागलाई बढी रञ्जक पुगेको प्रमाण मान्नुले पात्रमा गरिएको सुरुको गलत निष्कर्ष दोहोर्याउँछ। ग्रहण अपचयन, प्रसरण र पुनः अक्सिकरणको चक्र हो, र नीलो रूपको कुनै एक क्षणको दृश्यले त्यसको एउटा अंश मात्र देख्छ। प्रयोगशालामा रङ लगाउने र ह्यान्डल गर्ने प्रक्रिया तथा मात्रा र सम्पर्कमा आएको परिमाणसम्बन्धी दाबीहरूको व्याख्याका व्यावहारिक परिणाम यसैबाट सीधै निस्कन्छन्।