Paul Ehrlich og metylenblått: hvordan et fargestoff bidro til å forme legemiddelutviklingen

Paul Ehrlichs bidrag til medisinen var ikke et legemiddel. Det var et resonnement om hvordan man skulle undersøke et.

I 1878 leverte han en doktoravhandling der første del hadde tittelen «Den kjemiske forståelsen av farging». Resonnementet var at farging av et vevssnitt og farging av et tøystykke følger samme logikk. I begge tilfeller fester fargen seg på grunn av en kjemisk affinitet mellom fargestoffet og materialet, ikke fordi vevet er absorberende, fettholdig eller har en form som fanger pigment. Ehrlich hadde vokst opp med å se fetteren sin, patologen Karl Weigert, lage fargede vevssnitt. Det som fanget oppmerksomheten hans, var ikke bildene, men at fargestoffet valgte hvor det skulle gå.

Påstanden høres beskjeden ut. Det er den ikke. Hvis et fargestoff binder seg til et vev av kjemiske grunner, forteller fargemønsteret noe om kjemien i vevet. Et farget objektglass slutter å være en illustrasjon og blir en måling.

Han bygget straks videre på dette. I 1880 kombinerte han metylenblått med sur fuksin og kalte blandingen en nøytral farge, en neutralen Farbkörper. Den skilte mellom ulike typer hvite blodceller der de enkelte fargestoffene som da var i bruk, ikke klarte det. To år senere presenterte han en metode med metylfiolett for å farge tuberkelbasiller, og Koch tok metoden i bruk i sitt eget arbeid.

Teorien som senere ga disse metodene et felles grunnlag, er en egen sak, og tidfestingen blir ofte forenklet. Ehrlichs sidekjedeteori, ideen om at et stoff virker på en celle fordi de to er kjemisk forenlige, hører til 1890-årene, ikke til årene med fargestoffarbeid. Det det tidligere arbeidet ga, var overbevisningen som lå til grunn: Selektivitet er kjemisk, og derfor kan man lete etter den i stedet for å snuble over den.

Eksperimentet som gjorde fargestoffet til et kart

I 1885 utga Ehrlich en monografi om organismens oksygenbehov, med undertittelen en fargeanalytisk studie. Metoden var å injisere fargestoffer der fargen avhenger av oksidasjonstilstanden, og deretter sammenligne hvordan ulike organer reduserte eller bevarte dem. Fargestoffet ble brukt som et instrument, slik man bruker et termometer: Det fortalte om forhold inne i vev som ikke kunne undersøkes direkte. Ehrlich beskrev selv målet som å bestemme levende organers reduksjonsevne ved hjelp av bestemte fargestoffer.

Resultatet med metylenblått kom i 1886, i en artikkel om fargestoffets reaksjon med levende nervevev, som var blitt lest opp for en medisinsk forening i desember året før. Metylenblått ble tilført blodsirkulasjonen i et levende dyr. Deretter ble tynne vevssnitt tatt ut og eksponert for luft, slik at oppsamlet, fargeløst fargestoff ble oksidert tilbake til blått og viste hvor det hadde samlet seg. Nerveceller og nervefibre tok til seg fargen, og så selektivt at teknikken ble en standardmetode for å vise nervevev. Forbindelsen var ikke lenger bare et fargestoff påført et dødt vevssnitt på en laboratoriebenk. Den var en markør som fordelte seg inne i en levende kropp, og fordelingen kunne avleses.

Egenskapen som ligger til grunn for begge eksperimentene, fortjener å sies tydelig, fordi alt annet i denne historien avhenger av den. Metylenblått kan skifte form reversibelt. Den reduserte formen, leukometylenblått, er fargeløs, og ved kontakt med oksygen går den tilbake til det blå kationet. En glukoseløsning med fargestoffet i en lukket beholder er fargeløs; åpner man beholderen, blir den blå. Det er beskrevet at Ehrlich demonstrerte dette direkte ved å behandle fargede vevssnitt med jernklorid så vel som luft og se fargen komme tilbake. Et fargestoff som skifter farge med omgivelsenes redokstilstand, er en sonde for disse omgivelsene.

Dermed sto to egenskaper side om side. Et fargestoff kunne skille ett vev fra et annet. Og et fargestoff kunne slås av og på ved en endring i oksidasjonstilstand.

Sett i ettertid er den andre egenskapen begynnelsen på kjemoterapien. Hvis en forbindelse binder seg til én type vev og ikke en annen, kan den samme forbindelsen kanskje nå én type organisme og ikke en annen. Ehrlich uttrykte slutningen direkte: Hvis et patogen kunne farges selektivt, kunne fargingen tyde på en spesifikk skade på dette patogenet. Et fargestoff kunne derfor kanskje brukes som et legemiddel, rettet mot en inntrenger snarere enn mot pasienten.

Den første utprøvingen hos en pasient gjaldt ikke malaria. I 1890 rapporterte Ehrlich, sammen med psykiateren Arthur Leppmann, at metylenblått lindret smerte ved nevralgiske og revmatiske tilstander i muskler, ledd og sener. De to diskuterte om legemiddelet kunne virke ved psykisk sykdom, og bestemte seg for ikke å prøve det. En italiensk lege, Pietro Bodoni fra Genova, gikk likevel videre. Tittelen på artikkelen hans fra 1899 viser til en beroligende virkning ved ulike former for psykose: Han beskrev en beroligende effekt hos fjorten urolige pasienter og bemerket at andre leger i Genova allerede brukte fargestoffet til samme formål. Sedasjon er ikke en virkning på selve sykdommen, og dette skillet dukker stadig opp i denne historien.

Malariaarbeidet kom i 1891, sammen med patologen Paul Guttmann, ved Moabit-sykehuset i Berlin. Metylenblått ble gitt til to pasienter, og rapporten sto i Berliner klinische Wochenschrift fra 28. september 1891. I det første tilfellet tok pasienten 0.5 g av fargestoffet på én gang om kvelden 29. juni; det forventede anfallet utviklet seg ikke fullt ut, og den eneste plagen som ble registrert etterpå, var mild stranguri med blå urin. Feberanfallene forsvant i løpet av de første dagene, og parasittene var borte fra blodet senest den åttende dagen. Forfatternes egen oppsummering var at forventningene deres var blitt fullstendig innfridd. To ukontrollerte tilfeller er ikke et bevis. Den mer utførlige gjennomgangen av metylenblått og malaria, inkludert de moderne studiene, hører hjemme på en egen side. Det interessante spørsmålet her er snevrere: Hvor mye av Ehrlichs resonnement holdt stand i møte med parasitten?

Hvor resonnementet holdt, og hvor det sviktet

Lite av mekanismen holdt stand, i hvert fall ikke i den formen Ehrlich foreslo. Den ryddige forklaringen, der et flatt trisyklisk kation glir inn mellom baseparene i parasittens DNA, holder ikke for Plasmodium. Metylenblått reduseres så lett av en infisert rød blodcelle at det aldri når parasitten som et plant kation. Forklaringen om interkalering som passer for akridinfargestoffene, passer ikke for dette.

Det dokumentasjonen faktisk støtter, er mindre ryddig. Metylenblått hemmer parasittens glutationreduktase ved konsentrasjoner som kan oppnås hos en pasient. Det blokkerer omdanningen av hem til hemozoin, det inerte pigmentet parasitten danner for å unngå å bli forgiftet av sin egen nedbrytning av hemoglobin, omtrent like effektivt som klorokin og langt mer effektivt enn kinin. Redokssyklusen genererer også reaktive oksygenforbindelser i en celle som allerede produserer dem. Hvilken av disse som er den egentlige mekanismen, eller om alle bidrar, er fortsatt ikke avklart.

Det finnes en ytterligere komplikasjon, og den bør prege hvordan historiske påstander om denne forbindelsen leses. Kommersielt metylenblått fra denne perioden var ikke ett enkelt stoff. Prøvene inneholdt Azure B, den monodemetylerte analogen, og eldre løsninger samlet opp mer av det. Azure B er et metakromatisk fargestoff med andre mål: Det farger dobbelttrådet DNA dypblått og RNA grønt. En blanding av to fargestoffer med ulike bestemmelsessteder, i forhold ingen registrerte, kan ikke underbygge en entydig påstand om hva metylenblåttet i blandingen gjorde.

Selve fargestoffet fortrengte aldri kinin. Metoden klarte seg bedre. Ehrlichs elev Wilhelm Roehl, som arbeidet for fargestoff- og legemiddelkonsernet IG Farben, fortsatte å fremme fargestoffderivater som legemidler mot tropesykdommer og skaffet verktøyet som manglet: en kanarifugl infisert med fuglemalaria, som rutinemessig screeningmodell for kandidatforbindelser. Werner Schulemann endret deretter sidekjeden, og fenotiaziniumsaltet som ble resultatet, kurerte den eksperimentelle infeksjonen. Det gjorde fortsatt pasientene blå.

Det varige resultatet viste seg å være verken fargestoffet eller ringsystemet, men sidekjeden. Tilsetning av en dialkylaminoalkylaminogruppe endret molekylets oppførsel, og dette fragmentet overlevde alle senere omarbeidinger. Behold denne gruppen og bytt ut fenotiaziniumringen med en akridinring, så blir resultatet kinakrin. Sett inn en kinolinring, så blir resultatet klorokin. Pamakin, primakin og amodiakin, som alle fortsatt inngår blant malariamidlene, har den samme gruppen. Forbindelsen som mislyktes som behandling, leverte delen som lyktes.

Forbindelsen til antipsykotika går gjennom ringen snarere enn gjennom legemiddelet. Det var oppklaringen av metylenblåtts struktur som førte Heinrich August Bernthsen til den grunnleggende fenotiazinkjernen i 1883. Dette kjemiske rammeverket, med ulike substitusjoner, var det kjemikerne ved Rhône-Poulenc arbeidet med i 1940-årene mens de lette etter antihistaminer. En av disse forbindelsene ble syntetisert mot slutten av 1950 og testet av kirurgen Henri Laborit, som la merke til at den gjorde pasientene rolige og likegyldige. Den første publiserte psykiatriske bruken, hos en pasient med mani, kom i januar 1952. Det første antipsykotiske legemiddelet er ikke så mye en etterkommer av Ehrlichs malariamiddel som en fjern slektning av fargestoffet han begynte med.

Tre vaner det er verdt å ta med seg fra denne historien

1. «Det første syntetiske legemiddelet brukt i medisinen» beskriver en kategori, og forbeholdene er større enn uttrykket antyder. Uttrykket har blitt en gjenganger; en mye sitert oversiktsartikkel av Schirmer og kolleger i Neurobiology of Aging kaller metylenblått det aller første helsyntetiske legemiddelet brukt i medisinen. Kloralhydrat ble innført som et syntetisk beroligende middel i 1869, mer enn tjue år tidligere. Artikkelen fra 1891 gir selv en del av svaret, fordi forfatterne nevner de syntetiske febernedsettende midlene som allerede hadde sviktet mot malaria, blant dem kinolin, antipyrin og antifebrin. Ehrlichs eget arsenholdige middel mot syfilis kom enda senere. Den forsvarlige versjonen av påstanden handler om metode snarere enn om å være først: Metylenblått er blant de tidligste syntetiske forbindelsene som ble valgt for å virke mot en bestemt organisme på grunnlag av en kjemisk teori om selektivitet.
2. Selektiv fordeling er ikke selektiv nytte. Ehrlichs resultat fra 1886 var at fargestoffet går til nervevev. Hvor en forbindelse går, og hva den gjør når den kommer fram, er to ulike målinger, og den første er langt enklere å utføre. Det er i dette gapet de fleste påstandene om metylenblått og hjernen har holdt til siden.
3. Renhet hører til dokumentasjonen, ikke til markedsføringen. Den historiske dokumentasjonen er tvetydig av nettopp denne grunnen. Små strukturelle forskjeller endrer hvor denne forbindelsen går. Derfor må et analysesertifikat være knyttet til en bestemt batch, ikke tilbys som en generell erklæring om at et produkt er testet. En selger som hevder samsvar med farmakopémonografien, men bare tester tungmetaller, hevder mer enn rapporten underbygger. Blupreme kjøper metylenblått fra en farmasøytisk produsent og tester hele spesifikasjonen som monografien fastsetter: identitet, renhet, organiske urenheter, restløsemidler, elementære urenheter, gløderest, mikrobielle grenseverdier og bakterielle endotoksiner. Rapporten publiseres sammen med produktet, og siden om metylenblått av USP-kvalitet forklarer disse grenseverdiene og hvorfor resultatet for Azure B er det første man bør se etter.

Et datert kildespor

Den daterte rekken av milepæler, inkludert fargestoffkjemien som kom før Ehrlich, og kvalitetsgradene og spesifikasjonene som kom etter ham, er beskrevet separat i metylenblåtts historie. Selve forbindelsens identitet omtales i hva metylenblått er.

Illustrasjonene som ligger til grunn for denne framstillingen, gjengitt i oversiktsartikkelen fra 2012 av Krafts, Hempelmann og Skórska-Stania, er ikke likeverdige, og ett eksempel viser hvorfor. Plansjen fra 1891 er primærdokumentasjonen av forsøket; portrettet fra 1910 ved siden av tidfester et omdømme og ikke noe annet. Sidene fra Andersags notatbok fra 1934 er det direkte sporet etter kinolinsubstitusjonen, ført i kjemikerens egen hånd.

Den ærlige oppsummeringen av Ehrlichs fargestoffeksperimenter er at han traff med selektiviteten og målet, men bommet på mekanismen. Metylenblått konsentreres faktisk i nervevev og skader faktisk malariaparasitten. Det gjør ikke det andre på grunn av det første, og den kjemiske forklaringen han ga for begge deler, var feil. Det han demonstrerte hevet over tvil, var mer varig enn en riktig mekanisme: En forbindelse kan velges framfor å bli funnet, og den kan velges på grunnlag av dokumentasjon samlet inn før noen gir den til en pasient.