Kan metylenblått omgå mitokondrielt kompleks III? Hvorfor studiene er uenige

To laboratorier undersøkte om metylenblått kan omgå et blokkert mitokondrielt kompleks III. Det ene svarte nei. Det andre svarte ja. Begge hadde data.

Den første studien, med mitokondrier fra musehjerner, fant at fargestoffet ikke kan gjøre det. Den andre, med hjernemitokondrier fra tre gnagerarter, fant at det delvis kan gjøre det. En tredje studie, med muselever, siteres ofte i samme sammenheng, men undersøkte noe annet. Holder man den adskilt, forsvinner halvparten av forvirringen.

Det finnes ingen universell mekanisme å slå fast. Det finnes tre forsøk med ulike blokkere, doser og måleparametere. Les betingelsene først. Konklusjonene følger av dem.

Hva omgåelse betyr her

Elektroner kommer inn i kjeden gjennom kompleks I (fra NADH) eller kompleks II (fra suksinat), passerer gjennom kompleks III til cytokrom c og deretter gjennom kompleks IV til oksygen. Gradienten som bygges opp underveis, er det cellen bruker til å lage ATP.

En påstand om omgåelse innebærer at metylenblått tar opp elektroner oppstrøms for en blokkering og avgir dem nedstrøms. Det oksiderte fargestoffet tar imot elektroner fra NADH eller tidlige komponenter i kjeden og blir til leukometylenblått. Den reduserte formen overfører dem så til cytokrom c eller tilbake til kjeden. Hvis overføringen skjer nedstrøms for blokkeringen, gjenopprettes respirasjonen og membranpotensialet delvis. Hvis den skjer ved eller oppstrøms for blokkeringen, gjenopprettes ingenting.

Én detalj ved kompleks III avgjør mye av denne uenigheten. Komplekset driver en Q-syklus med to bindingssteder for hemmere. Antimycin binder seg til Qi-setet. Myxothiazol binder seg til Qo-setet. En studie som bare bruker én av dem, har bare testet halvparten av komplekset.

Studie én: ingen omgåelse i mitokondrier fra musehjerner

Gureev og kolleger brukte mitokondrier fra hjernebarken hos C57BL/6-mus, isolert med digitonin og undersøkt ved 0.1 mg protein per ml. Substratene dekket tre betingelser: pyruvat pluss malat ved 5 mM hver, suksinat ved 10 mM med glutamat ved 2 mM og L-prolin ved 10 mM. Blokkerne var rotenon ved 1 mikromolar (kompleks I) og antimycin ved 1 mikrogram per ml (kompleks III). Fargestoffdosene var 0.5, 1 og 2 mikromolar, med 1 mikromolar som hovedkonsentrasjon. Metoder og målekurver finnes i kortartikkelen i FEBS Letters.

Omgåelse av kompleks I fungerte. Rotenon reduserte ADP-stimulert respirasjon fra omtrent 121 til omtrent 2 nmol per minutt per mg, og 1 mikromolar fargestoff gjenopprettet den til omtrent 21. Membranpotensialet ble gjenopprettet med pyruvat pluss malat og med L-prolin.

Omgåelse av kompleks III fungerte ikke. Antimycin reduserte respirasjonen til omtrent 16, og fargestoffet økte den bare til omtrent 20. Membranpotensialet ble ikke gjenopprettet med noe substrat, ved fargestoffdoser opptil 5 mikromolar. Peroksiddataene pekte i samme retning: Fargestoff alene økte peroksidfrigjøringen fra en basalrate nær 76 pmol per minutt per mg til omtrent 1170, 1460 og 1945 ved de tre dosene, men antimycin reduserte dette fargestoffdrevne signalet med henholdsvis omtrent 25, 88 og 96 prosent. Hvis redusert fargestoff reagerte direkte med oksygen, skulle blokkering av kompleks III ikke undertrykke signalet. Forfatterne utledet at det reduserte fargestoffet oksideres ved Qo-setet i kompleks III, oppstrøms for antimycinblokkeringen. Den korte sløyfen, uttrykt med ord: fra donorer til fargestoff, fra fargestoff til Qo, deretter videre langs den vanlige ruten. Rotenon omgås. Antimycin omgås ikke.

Studie to: delvis omgåelse i tre arter, ved begge hemmerbindingsstedene

Svab og kolleger utvidet forsøksoppsettet. Hjernemitokondrier fra mus, rotter og marsvin ble isolert med Percoll og undersøkt ved samme konsentrasjon på 0.1 mg per ml, med pyruvat pluss malat eller glutamat pluss malat ved 5 mM hver. De brukte to blokkere av kompleks III: antimycin A ved 0.3 mikromolar og myxothiazol ved 1 mikromolar. Fargestoffkonsentrasjonen var 2 mikromolar i de fleste analysene og 0.5 i arbeidet med cytokrom c. Alle tre artene, med samsvarende protokoller, er beskrevet i artikkelen med åpen tilgang.

Begge blokkeringene ble delvis omgått i alle tre artene. I musemitokondrier undertrykte antimycin respirasjonen, og fargestoffet økte den med omtrent 60 prosent, fra omtrent 37 til 59 nmol per minutt per mg. Myxothiazol undertrykte den med 88 prosent, til omtrent 4.5, og fargestoffet femdoblet den til omtrent 23. Membranpotensialet ble delvis repolarisert under begge hemmerne, målt med to fargestoffer (safranin O og ratiometrisk TMRM) for å utelukke optiske artefakter.

Denne artikkelen testet også overføringen direkte, noe den første studien aldri gjorde. Eksogent acetylert cytokrom c ved 25 mikromolar ble ikke redusert av energiserte mitokondrier, verken med eller uten hemmere, men tilsetning av fargestoff drev reduksjonen i begge tilfeller. I cellefri buffer reduserte NADH pluss fargestoff cytokrom c med en hastighet proporsjonal med NADH. Det lengre spranget, uttrykt med ord: fra reduksjonsekvivalenter til fargestoff, fra fargestoff direkte til cytokrom c, fra kompleks IV til oksygen. Denne ruten hopper over hele kompleks III, slik at begge blokkerne kan omgås.

To ytterligere måleparametere støtter denne tolkningen. NAD(P)H-fluorescensen falt da fargestoff ble tilsatt mitokondrier behandlet med myxothiazol, noe som betyr at reduksjonsekvivalenter ble tappet gjennom den nye ruten. Og fargestoffets absorbans ved 660 nm fulgte hver tilsetning etter tur, mens sentrifugerte supernatanter viste at oksidert fargestoff ble oppkonsentrert mer enn hundre ganger inne i energiserte mitokondrier, og deretter forlot dem da potensialet kollapset. Protonregnskapet stemmer også: Når pumpetrinnene hoppes over, gjenstår omtrent 2 protoner per elektronpar i stedet for 10. Raskere oksygenforbruk med bare delvis repolarisering er derfor det man forventer av en reell omgåelse, ikke et argument mot den.

Det samme preparatet ga responser som gjør overfladisk lesning risikabelt. Med hemmer pluss fargestoff senket ADP respirasjonen i stedet for å øke den, og transportblokkering stimulerte den i stedet for å bremse den, mens membranpotensialet fortsatt endret seg i de vanlige retningene. Oksygenforbruk alene er misvisende i dette systemet.

Studie tre: leverstudien som testet kompleks I og II, ikke III

Lee og Boelsterli brukte mitokondrier fra muselever og dyrkede hepatocytter skadet av efavirenz (kompleks I, IC50 nær 30 mikromolar) og hydrazin, metabolitten av isoniazid (kompleks II, IC50 nær 30 mikromolar). Fargestoff ved omtrent 30 mikromolar gjenopprettet NADH-oksidasjon, membranpotensial og ATP, samtidig som det reduserte oksidanter og nekrotisk celledød. Artikkelen i Redox Biology modellerer dette som at fargestoffet transporterer elektroner rundt de skadede kompleksene I og II.

Dette resultatet er avklart bakgrunnskunnskap om forhold oppstrøms, og det sier ingenting om kompleks III, fordi ingenting ble blokkert der i forsøket. Det kan verken bekrefte eller avkrefte noen av hjernestudiene.

Betingelsesmatrisen

Fire grunner til at begge studiene av kompleks III kan ha rett om sitt eget oppsett

1. Blokkeringen var ikke det samme inngrepet. Antimycin alene ved 1 mikrogram per ml mot antimycin ved 0.3 mikromolar pluss en separat blokker av Qo-setet. En fargestoffrute som fører elektroner til Qo-setet, svikter nettopp der en rute direkte til cytokrom c lykkes. Ett bindingssted kan ikke representere begge.

2. Fargestoffdosen og tidsforløpet var ulike. Hovedkonsentrasjoner på 1 mot 2 mikromolar, for et stoff med redokssykluser der opptak og direkte reduksjon av cytokrom c avhenger av konsentrasjon og tid. Små doseforskjeller kombinert med ulike måletidspunkter kan synliggjøre forskjellige deler av det samme nettverket.

3. Preparatene var ulike. Isolering med digitonin og isolering med Percoll-gradient selekterer overlappende, men ikke identiske mitokondriepopulasjoner. Proteinkonsentrasjonen var den samme, 0.1 mg per ml, så den variabelen faller bort, men underpopulasjon og integritet gjør ikke det. Og artsforskjeller ble frikjent som forklaring: Den andre gruppen reproduserte sin fenotype også i mus.

4. Substratbetingelsene avgjør hva fargestoffet kan gjøre. Tre substratbetingelser mot NADH-koblede par. NADH-tilførsel og membranpotensial avgjør sammen hvor raskt fargestoffet reduseres, og hvordan det fordeler seg. En rute som trenger redusert fargestoff ved siden av oksidert cytokrom c, er avhengig av dette valget.

Hvordan lese den neste påstanden om omgåelse

Spør hvilket kompleks som ble blokkert, med hvilken hemmer, ved hvilket bindingssted og hvilken dose. Spør om fargestoffkonsentrasjonen og når målingen ble gjort. Spør om vev, art, isolering, proteinkonsentrasjon og substrat. Og spør om potensial, respirasjon, redokstilstand og en analyse av direkte overføring stemmer overens, fordi oksygenforbruk alene pekte i feil retning mer enn én gang her.

Den snevre oppsummeringen står seg. Det er enighet om at fargestoffet kan omgå kompleks I. For kompleks III viser musemitokondrier med antimycin ved 1 mikrogram per ml og fargestoff ved 1 mikromolar ingen funksjonell omgåelse, mens tre arter med antimycin ved 0.3 mikromolar eller myxothiazol ved 1 mikromolar og fargestoff ved 2 mikromolar viser delvis omgåelse med direkte overføring fra fargestoff til cytokrom c. Disse utsagnene kan stå side om side. Alt mer vidtrekkende er ekstrapolering.

Relatert lesning holder den omstridte påstanden innenfor uomstridt kjemi: hvordan metylenblått flytter elektroner om elektronstafetten, forsøkene med omgåelse av kompleks I om det avklarte tilfellet oppstrøms, målinger av membranpotensial og tilhørende artefakter om hvorfor to fargestoffer var nødvendige, og laboratoriehåndtering av stoffer med redokssykluser om fallgruvene ved dosering og tidsforløp.