Metylenblåtts løselighet i vann og tilberedning av løsning fra pulver

To teknikere lager hver sin 1 prosent metylenblåttløsning fra pulver. Den ene veier inn 1.00 gram og fyller kolben opp til 100 mL. Den andre veier inn 1.00 gram, tilsetter det til 100 mL vann og anser seg ferdig. En tredje tekniker veier inn 1.00 gram fra et annet parti og får en målbart annen konsentrasjon. Alle tre flaskene er merket likt. Ingen av dem inneholder helt det etiketten angir, og forskjellene skyldes tre forhold som er lette å forveksle: hvor mye løsemiddelet kan løse opp, hva det innveide pulveret faktisk er, og hva prosenttallet viser til.

Denne veiledningen gjelder bare formulering i laboratoriet: fargeløsninger, indikatorer, analytiske stamløsninger og arbeidsfortynninger. Den er ikke en oppskrift på legemidler til oral bruk eller injeksjon, og konsentrasjonene her skal ikke tolkes som doser.

Hva løseligheten setter grenser for, og hva den ikke gjør

Metylenblått har høy løselighet i vann til å være et fargestoff. PubChems stoffoppføring for metylenblått oppgir omtrent 43.6 gram per liter ved 25 C, som tilsvarer 4.36 gram per 100 mL, eller 4.36 prosent w/v. En uavhengig likevektsstudie ved samme temperatur målte 43.21 g/L og bekreftet den eldre verdien innenfor forsøksusikkerheten.

Dette tallet er en øvre grense, ikke et mål. En stamløsning på 1 prosent er 10 g/L, mindre enn en fjerdedel av grensen. En stamløsning på 0.1 prosent er 1 g/L, omtrent en førtiendedel av den. Hvis en tilberedning på 1 prosent fortsatt inneholder faste partikler etter grundig blanding ved romtemperatur, er problemet nesten aldri løselighetsgrensen. Vanligvis skyldes det ufullstendig fukting, kaldt vann, pulverklumper som trenger mer tid, eller et oppløst stoff som er feilidentifisert. Varmt vann og omrøring løser de fleste av disse problemene. Hvis løsningen er varmet opp, lar du kolben komme tilbake til kalibreringstemperaturen før du fyller opp til sluttvolumet.

Løseligheten i andre løsemidler er lavere og varierer mer mellom kildene, delvis fordi hydrattilstanden til materialet som er testet, varierer. Vann er fortsatt referanseløsemiddelet for rutinemessige stamløsninger i laboratoriet. Etanol løser opp fargestoffet, men kan løse opp vesentlig mindre enn vann. Kloroform løser det også opp, pyridin bare i liten grad, og dietyleter praktisk talt ikke. Aceton og etylacetat ligger langt under vann i målte serier. Ved arbeid med ikke-vandige løsninger bør du behandle håndbokverdier som et første anslag og kontrollere dem med det aktuelle partiet, ikke som en grense for formuleringen. Det praktiske poenget er enkelt: Hvis målet er en definert vandig konsentrasjon på eller under 1 prosent, gir vann god margin.

Pulveret er ikke én entydig substans

Metylenblåttpulver som selges til laboratoriebruk, er et kloridsalt med vann i krystallgitteret, og mengden av dette vannet varierer. Det vannfrie ionet har en molekylvekt på 319.85 g/mol. Det ofte oppgitte trihydratet har en molekylvekt på 373.90 g/mol, og pentahydratet 409.93 g/mol. Disse verdiene er tabulert i USP-monografidataene som er oppsummert sammen med PubChem-oppføringen.

Kommersielle flasker er ofte merket trihydrat, CAS 7220-79-3, men faststoffstudier har vist at det faktiske materialet kan være et pentahydrat, et delvis hydrat med rundt 2.2 vannmolekyler, et dihydrat eller et monohydrat. Enkelte analyser har ikke påvist noen egen krystallinsk trihydratfase. Fargestoffet er også hygroskopisk, slik at vanninnholdet i en åpnet flaske endrer seg over tid. For kvalitativ farging har dette knapt noen betydning. For kvantitativt analytisk arbeid har det stor betydning. Derfor legger veiledningen om å lese innholdsanalyse og vanninnhold i et analysesertifikat større vekt på partidokumentasjonen enn på ordet trihydrat på etiketten.

Dette gir to måter å korrigere på, og bare én skal brukes om gangen. Hvis sertifikatet oppgir innholdsanalyse og vanninnhold eller tørketap, bruker du disse tallene direkte. Hvis det ikke finnes sertifikatdata og konsentrasjonen må uttrykkes som vannfri ekvivalent, bruker du den teoretiske hydratfaktoren: 373.90 delt på 319.85, eller 1.169, for nominelt trihydrat, og 409.93 delt på 319.85, eller 1.282, for nominelt pentahydrat. Ikke bruk begge korreksjonene samtidig. Da telles vannet dobbelt.

Hva prosent betyr

Prosent w/v betyr gram av det angitte oppløste stoffet per 100 mL ferdig løsning, ikke per 100 mL vann ved start. Dermed er 1 prosent w/v 1.000 g per 100 mL sluttvolum, tilsvarende 10 mg/mL eller 10 g/L. En løsning på 0.1 prosent er 0.100 g per 100 mL sluttvolum, tilsvarende 1 mg/mL. Den vanlige forvekslingen av 1 prosent med 1 mg/mL gir en feil på en faktor ti, og det er verdt å kontrollere alle etiketter for dette.

Den andre delen av definisjonen er spesifikasjonen av det oppløste stoffet. En 1 prosent løsning av trihydratpulver basert på innveid masse og en 1 prosent løsning uttrykt som vannfri ekvivalent er forskjellige løsninger. Regneeksemplene nedenfor angir både sluttvolum og beregningsgrunnlag hver gang. Denne vanen forebygger problemet med de tre teknikerne ovenfor.

Tilberedningseksempler med angitte hydratforutsetninger

Alle eksemplene forutsetter rent pulver av det angitte hydratet og vann som løsemiddel ved romtemperatur. Skaler lineært for andre volumer.

Eksempel A: 100.0 mL med 1 prosent w/v, basert på innveid trihydrat. Vei inn 1.000 g metylenblått-trihydrat. Tilsett omtrent 70 mL renset vann, rør eller sving beholderen til alt er oppløst, overfør kvantitativt til en 100.0 mL målekolbe med skylling, og tilsett deretter vann til merket. Det oppløste stoffet er selve trihydratet, så ingen molekylvektkorreksjon skal brukes. Resultat: 1.000 g per 100.0 mL sluttvolum, eller 10 mg/mL basert på innveid pulver.

Eksempel B: 100.0 mL med 1 mg/mL, uttrykt som vannfri ekvivalent, fra nominelt trihydrat. Målet er 100.0 mg vannfritt metylenblått i 100.0 mL sluttvolum. Multipliser med 1.169 for å korrigere for de tre vannmolekylene: 100.0 mg ganger 1.169 er lik 116.9 mg. Vei inn 116.9 mg nominelt trihydrat, løs det opp i omtrent 70 mL vann, og fyll opp til 100.0 mL sluttvolum i en målekolbe. For nominelt pentahydrat er faktoren 1.282, så samme mål krever 128.2 mg. Angi på etiketten hvilken faktor som ble brukt.

Eksempel C: fortynning av metylenblått fra en stamløsning på 1 prosent til 0.1 prosent. Bruk C1V1 er lik C2V2. For å lage 100.0 mL med 0.1 prosent fra en stamløsning på 1.0 prosent er nødvendig volum stamløsning 0.1 ganger 100.0 delt på 1.0, som er 10.0 mL. Pipetter 10.0 mL av stamløsningen på 1 prosent i en 100.0 mL kolbe og tilsett vann til merket. For analytikere som foretrekker masseenheter: 1 prosent er 10 mg/mL, så 10.0 mL inneholder 100 mg, og 100 mg i 100.0 mL sluttvolum er 1 mg/mL, som er 0.1 prosent.

Eksempel D: 1.000 L arbeidsløsning på 10 mg/L fra en stamløsning på 1 mg/mL. En stamløsning på 1 mg/mL er 1000 mg/L. Nødvendig volum er 10 ganger 1.000 delt på 1000, som er 0.0100 L, eller 10.0 mL. Pipetter 10.0 mL stamløsning og fortynn med vann til 1.000 L sluttvolum. Fra en stamløsning på 1 prosent med 10,000 mg/L krever samme mål bare 1.00 mL fylt opp til 1.000 L. Seriefortynning i to trinn gir bedre nøyaktighet enn én enkelt overføring i mikroliterskala når forholdet overstiger omtrent hundre.

Hvert av disse eksemplene er en fullstendig spesifikasjon bare fordi det inneholder tre opplysninger: innveid masse med tilhørende hydratforutsetning, løsningens sluttvolum og grunnlaget for den angitte konsentrasjonen. En oppføring i laboratoriejournalen som mangler én av disse tre, kan ikke reproduseres nøyaktig.

Fremgangsmåte som unngår de vanlige feilene

Løs først opp pulveret i mindre enn sluttvolumet, og fyll deretter opp til volum. Hvis pulveret tilsettes direkte til hele sluttvolumet av vann, får løsningen et totalvolum som overstiger det tiltenkte merket, og konsentrasjonen blir for lav. Skyll begerglasset over i kolben slik at ingen farge blir igjen. Den sterke fargen gjør små tap synlige, noe som er en fordel hvis det bidrar til kvantitativ overføring.

Bland til ingen partikler er igjen før du fyller opp til volum, og kontroller mot lyset. Filtrer bare når metoden krever det. Metylenblått adsorberes til enkelte membranmaterialer, så filtrering kan senke konsentrasjonen i en stamløsning som nettopp er standardisert. Dette er dokumentert i studier av membranadsorpsjon og er verdt å huske når filtrering eller konsentrasjonskontroll inngår i metoden. Hvis en filtrert stamløsning må ha en sertifisert konsentrasjon, kontrollerer du konsentrasjonen etter filtrering, ikke før.

Oppbevar ferdige løsninger beskyttet mot sterkt lys i brune eller ugjennomsiktige flasker ved romtemperatur, og merk dem med oppløst stoff, hydratgrunnlag, konsentrasjon, løsemiddel, dato og hvem som laget løsningen. Fotobleking ved vedvarende belysning er en kjent nedbrytningsmekanisme, så vinduskarmer og opplyste kjøleskap er dårlige oppbevaringssteder selv om fargestoffet ser stabilt ut. Forventet stabilitet og intervaller for ny kontroll hører hjemme i veiledningen om oppbevaring og stabilitet for ferdige løsninger, men som arbeidsregel bør analytiske stamløsninger lages på nytt eller kontrolleres på nytt fremfor å anses som pålitelige på ubestemt tid.

Håndter pulveret og konsentrerte stamløsninger med hansker, øyevern, laboratoriefrakk og tildekking av arbeidsbenken, og bruk sekundær oppsamling for flasker. Fargestoffet setter raskt flekker på hud, klær, benker og plast, og leverandørenes sikkerhetsdatablader klassifiserer pulveret som skadelig ved svelging og irriterende for øyne og hud, avhengig av kvalitet. Fullstendige forholdsregler hører hjemme i rutiner for sikker håndtering og oppbevaring, men kontroll med fargesøl er i seg selv et kvalitetstiltak: fargestoffrester på glassutstyr og pipetter er en kilde til krysskontaminering ved sporanalyse.

En merknad om kvalitet

Til fargebad og demonstrasjoner fungerer enhver ren laboratoriekvalitet som er tilberedt med riktig konsentrasjon. Ved kvantitativt arbeid eller sammenligninger er kvaliteten viktig fordi urenhetene varierer: rester av Azure B og beslektede tiaziner, tungmetaller, rester av løsemidler og mikrobiell belastning. Derfor er valg av en kvalitet med et fullstendig analysesertifikat en del av formuleringen, ikke noe som vurderes i etterkant. Fullstendig partidokumentasjon oppgir identitet, innholdsanalyse med beregningsgrunnlag, vanninnhold og hvilke urenheter det faktisk er testet for. Da bruker hydratkorreksjonen i eksemplene ovenfor målte verdier i stedet for antakelsen om nominelt trihydrat. Når to partier gir ulike konsentrasjoner fra samme innveide masse, forklarer sertifikatet vanligvis hvorfor.