Metylenblått og ferroptose: jern, lipidperoksidasjon og celledød

Ferroptose er celledød som skyldes membranskade. Flerumettet fett i membraner oksideres i en kjedereaksjon, membranen svikter, og cellen dør. Jern er nødvendig for kjemien. Denne setningen rommer hele konseptet, og alt i denne artikkelen er en utprøving av én del av det.

Spørsmålet her er mer avgrenset: Hva gjør metylenblått med denne kjeden i celleforsøk, og hva viser resultatet egentlig? Det korte svaret er at metylenblått i nanomolare konsentrasjoner i to laboratoriestudier reduserte mitokondriell lipidperoksidasjon og holdt celler i live etter utløsende påvirkninger som ellers forårsaker ferroptose. Det lengre svaret er viktigere, fordi hvert ledd i kjeden ble testet med et forskjellig inngrep, og hvert inngrep har begrensninger.

Ferroptose i ett avsnitt

Et membranfosfolipid med en flerumettet fettsyrehale har et svakt punkt: hydrogenatomer som lett kan stjeles. Når et radikal stjeler ett av dem, bindes oksygen til lipidet, et lipidperoksylradikal dannes, og dette radikalet stjeler fra det neste lipidet. Reaksjonen forplanter seg langs membranen med mindre noe stopper den.

Det viktigste stoppsignalet er et enzym kalt GPX4, som bruker glutation til å redusere lipidperoksider til ufarlige lipidalkoholer. Utløsende stoffer i laboratoriet angriper dette forsvaret på bestemte punkter. Erastin blokkerer import av cystin gjennom system xc-minus, noe som fratar cellen cystein til glutationsyntesen. Butioninsulfoksimin blokkerer glutationsyntesen direkte. RSL3 hemmer selve GPX4. Alle tre gjør at peroksider ikke fjernes, men de virker på forskjellige trinn, så et resultat med ett utløsende stoff kan ikke automatisk generaliseres til de andre.

Ferroptose skiller seg fra apoptose gjennom egenskapene som definerer den. Det finnes ingen kaspasekaskade og ingen apoptotiske legemer. Jernkelatorer som deferoksamin og radikalfangende stoffer som ferrostatin-1 undertrykker den. Dette er den praktiske testen forskere bruker for å betegne celledød som ferroptotisk, snarere enn bare nekrotisk. Det bredere bildet av regulerte celledødsveier setter dette skillet i sammenheng, og cellenes håndtering av labilt jern forklarer hvorfor kelatering er en så avgjørende kontroll.

Hvor mitokondriene passer inn, og hvorfor det var omstridt

Tidlige studier rapporterte at celler uten mitokondrielt DNA fortsatt gjennomgår ferroptose, noe som tydet på at mitokondrier ikke er nødvendige. Senere studier fant at fjerning av mitokondrier eller blokkering av respirasjonen kan undertrykke ferroptose som skyldes cysteinmangel, men ikke ferroptose fra direkte GPX4-hemming. Begge resultatene kan være riktige dersom mitokondrienes bidrag avhenger av den utløsende påvirkningen, celletypen og hvor den avgjørende peroksidasjonen skjer.

Studien som denne artikkelen bygger på, undersøkte uenigheten med en probe som er spesifikk for ett cellekompartment. MitoCLox er en mitokondriemålrettet versjon av en reporter for lipidperoksidasjon: Den endrer fluorescens når den møter lipidperoksylradikaler inne i mitokondriene. I fibroblaster behandlet med erastin oppsto oksidasjon av den mitokondrielle proben i fortsatt levende celler før celledød, og den varierte mellom cellene i populasjonen. Dette tidsforløpet er viktig. Peroksidasjon som kommer før celledød, kan være en årsak. Peroksidasjon som bare måles i døde celler, er rester etter skaden. En tilhørende veiledning om analyser av lipidperoksidasjon og hva hver probe rapporterer forklarer hvorfor probens plassering avgjør hva et signal betyr.

Det samme mønsteret oppsto i en annen modell. Fibroblaster fra en pasient med Lebers hereditære optikusnevropati, som har en mutasjon i kompleks I og høyere oksidativt stress i utgangspunktet, døde ved ferroptose når glutation ble uttømt, mens kontrollfibroblastene motsto dette. Oksidasjon av den mitokondrielle proben kom igjen først. Detaljene finnes i fibroblaststudien av mitokondriell lipidperoksidasjon ved ferroptose.

Hva metylenblått endret i disse forsøkene

Metylenblått er en redoksbærer. Den oksiderte formen tar imot elektroner fra NADH-knyttede reaksjoner ved kompleks I, og den reduserte formen overfører dem til cytokrom c, som leverer dem videre til kompleks IV. Dette skaper en delvis omgåelse av den delen av kjeden der elektroner normalt lekker til oksygen og danner superoksid. Lesere som ønsker hele bildet av elektronoverføringen, bør begynne med hvordan metylenblått flytter elektroner gjennom mitokondriene.

I lungefibroblaster behandlet med erastin bevarte metylenblått ved 250 nanomolar levedyktigheten i en måling av celleoverlevelse, i likhet med de mitokondriemålrettede antioksidantene SkQ1 og MitoTEMPO. Kontrollene avgrenser påstanden. Ferrostatin-1, alfa-tokoferol og deferoksamin ga også beskyttelse, noe som bekrefter at celledøden var ferroptotisk. SkQ1-analogen uten en antioksidantgruppe ga ingen beskyttelse, noe som peker mot redokskjemi snarere enn uspesifikk opphopning. Beskyttelsen avtok over omtrent 200 nanomolar SkQ1, i samsvar med den kjente prooksidative virkningen til kinonantioksidanter ved høyere belastning. Metylenblått har den samme tosidige doseavhengige virkningen: Det er beskyttende ved lave nanomolare nivåer i disse kulturskålene, men kan danne hydrogenperoksid gjennom redokssykling når konsentrasjonen økes eller stoffet belyses kraftig. Denne typen dosekontekst omtales i reaktive oksygenforbindelser i mitokondriene.

Forsøkene med isolerte mitokondrier skilte deretter mellom ROS-kildene. I nærvær av jern(II) stimulerte substrater som leverer elektroner til kompleks I, sammen med rotenon, oksidasjon av proben. Rotenon blokkerer nedstrøms for flavinstedet, slik at oppstrøms elektronbærere forblir reduserte og lekker elektroner til oksygen fra flavinet som vender mot matriksen. Substrater som leverer elektroner til kompleks III, sammen med antimycin A, produserte rikelig med hydrogenperoksid, men drev ikke lipidperoksidasjon. Samme samlede ROS-signal, forskjellig plassering, forskjellig utfall. Både SkQ1 og metylenblått undertrykte peroksidasjonen drevet av kompleks I uten å undertrykke selve produksjonen av hydrogenperoksid. Dette plasserer virkningen deres etter ROS-dannelsen, på lipidperoksidasjonstrinnet.

Forsøkene med jernoverskudd og ledetråden fra lipofuscin

En annen studie undersøkte spørsmålet fra jernsiden. H9c2-kardiomyocytter eksponert for submillimolare konsentrasjoner av ammoniumjern(III)sitrat utviklet mitokondrielle ROS, mitokondriell lipidperoksidasjon og deretter ferroptose, etterfulgt av opphopning av et lipofuscinlignende pigment innen 24 timer. Lipofuscin er den autofluorescerende, jernholdige resten av oksiderte lipider og proteiner som hoper seg opp med alderen. Den raske dannelsen her knytter akutt jerndrevet peroksidasjon til en klassisk aldringsmarkør. Både metylenblått i nanomolare konsentrasjoner og SkQ1 hindret peroksidasjonen, celledøden og pigmentopphopningen. Isolerte hjertemitokondrier bekreftet mønsteret: Rotenon sammen med jern(II) drev peroksidasjon og et pigmentlignende signal, og begge stoffene blokkerte dette. Hele forløpet er beskrevet i studien av jernoverskudd i H9c2-kardiomyocytter. Pigmentdelen av historien hører sammen med lipofuscin og markører for cellulær aldring.

Hva analyser av celleoverlevelse ikke viser

En levedyktighetsmåling som CellTiterBlue viser hvor mange celler i en kulturskål som fortsatt er metabolsk aktive etter en utløsende påvirkning sammen med et mulig beskyttende stoff. Dette er en test av en mekanisme i et definert system. Det er ikke et behandlingsresultat. Ingen av disse forsøkene ga en pasient en dose, målte et sykdomsendepunkt eller fastslo et terapeutisk vindu i en kropp.

Fire begrensninger bør nevnes uttrykkelig. For det første er utvalget av celletyper snevert: transformerte lungefibroblaster, primære hudfibroblaster, inkludert én cellelinje med mitokondriell sykdom, og en kardiomyocyttlinje fra rotte, i tillegg til isolerte mitokondrier fra rottehjerter. Følsomheten varierte mellom cellelinjene, og LHON-linjen var valgt nettopp fordi den var uvanlig sårbar. For det andre er de utløsende påvirkningene ekstreme laboratoriebetingelser: fullstendig blokkering av transport eller syntese, og jernbelastninger som intet vev ville bli utsatt for akutt. For det tredje kan konsentrasjon ikke omregnes ved enkel multiplikasjon. Nanomolare konsentrasjoner i dyrkningsmedium er ikke en dose til mennesker. Fordelingen av metylenblått, reduksjonen til den fargeløse formen i blod og vev, lyseksponering og membranpotensial ligger alle mellom en kulturskål og et menneske. For det fjerde rapporterer probene fra sitt eget kompartment. Oksidasjon av MitoCLox viser at mitokondrielle lipidradikaler ble dannet. Den viser ikke at ruptur av plasmamembranen, som trolig er den avsluttende hendelsen, ble hindret direkte snarere enn unngått gjennom en oppstrøms virkning.

Den redelige påstanden er derfor denne: I disse modellene driver ROS fra kompleks I sammen med jern mitokondriell lipidperoksidasjon som kommer før ferroptose, og metylenblått ved lave konsentrasjoner avbryter denne delen av forløpet. Alt utover denne delen krever andre forsøk i dyr og deretter i mennesker.