Hvorfor absorpsjonen til metylenblått endres med konsentrasjonen

Ta en flaske med stamløsning av metylenblått og hell i to glass. Fyll det første med stamløsningen og det andre med en tidobbel fortynning. Det andre glasset er blekere, som forventet. Se nøye etter, så oppdager du at noe annet også har endret seg. Fargetonen har forskjøvet seg. Den ene løsningen heller mot klart himmelblått, den andre mot blått med et fiolett skjær. Fortynningen gjorde mer enn å redusere intensiteten. Den endret hvilken kjemisk art som står for mesteparten av absorpsjonen.

Prinsippet bak forskyvningen er enkelt. Oppløst metylenblått består ikke av én enkelt kjemisk art. Det enkelte fargestoffkationet, kalt monomeren, kan stable seg flate mot flate med et annet kation og danne en dimer, og dimerer kan vokse til større aggregater. Hver form har sitt eget absorpsjonsspekter. Det et spektrofotometer viser, er summen fra blandingen som finnes i akkurat den kyvetten, under akkurat de betingelsene. Endrer du blandingen, forskyves spekteret, selv når det totale fargestoffinnholdet følger et enkelt fortynningsforhold.

Monomerer og dimerer absorberer forskjellig

Se for deg monomeren som et flatt kort med en positiv ladning fordelt over ringsystemet. To slike kort kan ligge flate mot flate. De positive ladningene frastøter hverandre, men de flate aromatiske overflatene tiltrekker hverandre gjennom stablingsinteraksjoner, og vannet og motionene rundt skjermer frastøtningen. Resultatet er et bundet par med felles elektroniske tilstander. De tillatte overgangene ligger ved høyere energi enn monomerovergangen, så dimerbåndet vises ved kortere bølgelengde enn monomerbåndet, mens større aggregater bidrar med en skulder enda lenger mot den blå siden.

Ved svært lav konsentrasjon i rent vann dominerer monomerene, og båndet ved lang bølgelengde dominerer. Når totalkonsentrasjonen øker, får den parede formen en stadig større andel, og båndet ved kortere bølgelengde vokser i forhold til det første. Forholdet mellom de to båndene viser derfor blandingens sammensetning, ikke totalkonsentrasjonen direkte. En måling ved én enkelt bølgelengde kan ikke skille de to uten en antakelse om hvilken form som er til stede.

Derfor må referansespektre alltid oppgis sammen med betingelsene. Spektralreferansen for metylenblått angir båndposisjonene i en tabell sammen med løsemiddel, saltbakgrunn, pH, temperatur og konsentrasjonsområde som lå til grunn for dem. Oppgir du en topp uten disse betingelsene, er tallet utilstrekkelig spesifisert. To laboratorier kan begge ha rett om ulike spektre fra det samme fargestoffet fordi de målte forskjellige blandinger.

Hva som forskyver likevekten

Konsentrasjonen er den viktigste påvirkningsfaktoren. Dimerdannelse krever at to monomerer møtes, så dimerandelen øker raskere enn lineært med den totale fargestoffkonsentrasjonen. Rapporterte dimeriseringskonstanter i vann ligger i tusentalls per molar nær romtemperatur, så dimerandelen stiger bratt gjennom det mikromolare området. En bred global modelltilpasning som dekket fargestoffkonsentrasjoner fra mikromolart til millimolart nivå, fant et tetramerbidrag større enn null allerede under 34 mikromolar. Det er en advarsel mot å stole på en modell med bare to kjemiske arter ved konsentrasjoner på titalls mikromolar. De nøyaktige andelene avhenger av mediet, og derfor beskriver denne artikkelen retninger fremfor å gi en universell omregningstabell.

Salt er den andre påvirkningsfaktoren. Oppløste ioner skjermer frastøtningen mellom to kationer, så tilsatt natriumklorid og lignende elektrolytter forskyver blandingen mot dimerer og aggregater ved samme fargestoffkonsentrasjon. Denne effekten er synlig i studier av aggregering av metylenblått i saltholdige og vandige medier, der fargestoff fra omtrent 1 mikromolar til 3.4 millimolar ble målt ved natriumkloridkonsentrasjoner fra 0 til 0.15 molar. I denne modelltilpasningen nådde tetramerandelen omtrent 0.93 ved kombinasjonen av høy fargestoffkonsentrasjon og høyt saltinnhold. Et spekter registrert i vann og et registrert i fysiologisk saltvann er derfor ikke utbyttbare standarder.

Temperaturen trekker i motsatt retning. Stabling frigjør bundet vann og motvirkes av termisk bevegelse, så oppvarming av en løsning fører vanligvis til at noen dimerer dissosierer tilbake til monomerer, mens avkjøling favoriserer assosiasjon. Den tilpassede dissosiasjonsentalpien er negativ, omtrent minus 30 kilojoule per mol i området 282 til 333 kelvin, noe som bekrefter eksoterm assosiasjon. En kald prøve målt rett etter kjølelagring kan fremstå som mer aggregert enn den samme prøven målt etter at den har nådd likevekt ved romtemperatur.

Løsemiddelet setter utgangspunktet. Vann, med sin sterke hydrofobe effekt, fremmer stabling av flate fargestoffkationer. Alkoholer som etanol og metanol solvatiserer ringene bedre og bryter opp aggregater, så ved samme fargestoffkonsentrasjon fremstår løsningen som mer monomerisk i etanol enn i vann. Apro­tiske hjelpeløsemidler gjør det samme: I blandinger av vann og DMSO ved 293 kelvin undertrykte tilsatt DMSO dimerisering, noe som peker på vannstrukturen som en drivkraft for stabling. Tensider krever oppmerksomhet i begge retninger. Over den kritiske micellekonsentrasjonen kan miceller solubilisere monomerer enkeltvis og gjenopprette et monomerlignende spekter. Under dette punktet kan et motsatt ladet tensid i stedet fremme stabling: Ved 100 mikromolar fargestoff nådde SDS-drevet polymerisering en topp nær 4 millimolar SDS, omtrent halvparten av micellekonsentrasjonen, før en omfordeling fant sted ved høyere tensidnivåer. Arbeid med effekter av løsemidler og organiserte medier på spektrene til metylenblått illustrerer hvor sterkt de nærmeste molekylære omgivelsene, ikke bare konsentrasjonen i løsningen som helhet, bestemmer de observerte båndene.

pH har betydning hovedsakelig ved ytterpunktene. I det tilnærmet nøytrale området som brukes i det meste av laboratoriearbeidet, beholder metylenblått sin velkjente kationiske, blå form, og aggregering dominerer spektralendringene. Sterk syre eller base, redokskjemi som gir den fargeløse leukoformen, eller binding til proteiner og partikler tilfører hver for seg tilstander utover monomer-dimer-paret. Når et spekter endres etter tilsetting av en buffer, bør du undersøke buffersammensetningen for salt og bindende komponenter før du tilskriver alt pH alene. Referansen om kjemi og protonering holder disse spørsmålene om kjemisk identitet atskilt fra aggregeringsspørsmålet som behandles her.

Hvorfor den rette Beer-Lambert-linjen bøyer seg

Beer-Lamberts lov sier at absorbansen er lik absorptiviteten multiplisert med konsentrasjonen og lysveien. Det er en tellelov. Den forutsetter at objektene som telles, forblir identiske når antallet endres: én absorberende kjemisk art, et fast spekter, ingen konsentrasjonsavhengig kjemi, monokromatisk målelys, ingen spredning eller reemisjon, og lys som faktisk følger den oppgitte lysveien.

Aggregering bryter den første forutsetningen. Formelt forblir totalabsorbansen en sum over kjemiske arter: lysveien multiplisert med hver arts absorptivitet og dens egen konsentrasjon. Hver art følger loven. Blandingen gjør det ikke, fordi konsentrasjonene av de enkelte artene er ikke-lineære funksjoner av den totale fargestoffkonsentrasjonen. En kalibreringskurve for absorbans ved monomerbåndet mot total fargestoffkonsentrasjon starter derfor rett i grensen for svært fortynnede løsninger og bøyer seg nedover når konsentrasjonen øker, fordi hver økning tilfører forholdsmessig mindre monomer. En kurve målt ved dimerbåndet bøyer seg motsatt vei. Studier av aggregering peker på nettopp denne mekanismen som årsaken til de observerte avvikene fra Lambert-Beers lov. Å tilpasse en rett linje gjennom det bøyde området og ekstrapolere den er den typiske feilen. Linjen er bare gyldig innenfor området og matrisen den ble etablert i.

Fortynning skaper en beslektet fallgruve. Å fortynne en konsentrert stamløsning for å komme innenfor instrumentets måleområde bevarer ikke forholdet mellom de kjemiske artene. Den fortynnede løsningen i kyvetten innstiller en ny likevekt mot monomer, så spekteret beskriver den fortynnede prøven riktig, men stamløsningen feil. Tilbakeberegning av stamløsningens spekter ved å skalere absorbansene opp gir bare et korrekt anslag over totalinnholdet dersom kalibreringen allerede tar hensyn til forskyvningen. Den gjenskaper aldri den opprinnelige båndformen. Den som sammenligner spekteret til en konsentrert løsning med en fortynnet referanse, sammenligner to forskjellige blandinger.

Lysveien er en del av resultatet

Absorbansen skalerer med avstanden lyset tilbakelegger gjennom prøven. En 10 mm kyvette gir ti ganger absorbansen til en 1 mm kyvette med samme løsning. Denne skaleringen er nøyaktig bare for den samme løsningen, og aggregering gjør dette forbeholdet avgjørende.

I praksis er lysveien et verktøy for å holde seg innenfor det gyldige området. En lang lysvei gir følsomhet for fortynnede løsninger som hovedsakelig består av monomerer. En kort lysvei holder en konsentrert prøve innenfor måleområdet uten en stor fortynning som ville endret likevekten. Aggregeringsstudien bak tallene ovenfor gjorde nettopp dette: 1 centimeter kyvetter for 1.1 til 34 mikromolar fargestoff, og 0.01 centimeter kyvetter for 94 mikromolar til 3.4 millimolar. Mikrovolumplattformer og platelesere har sin egen geometri, med korte og noen ganger variable lysveier samt overflater der kationisk fargestoff kan adsorberes. Oppgi lysveien sammen med tallet, på samme måte som spektralreferansen oppgir løsemiddel og salt. En absorbans uten en lysvei er ikke et resultat. Det er et rykte.

God måledisiplin følger av mekanismen. La prøvene nå likevekt ved samme temperatur før måling. Bruk samme kyvettetype og orientering, tilpassede blankprøver med samme salt- og bufferbakgrunn og rent glassutstyr, fordi metylenblått adsorberes til glass og plast, og en misfarget kyvette bærer med seg et minne om den siste konsentrerte prøven. Mål raskt etter tilberedning når aggregeringskinetikken er viktig, og etabler hver kalibreringskurve i samme matrise og med samme lysvei som prøvene med ukjent konsentrasjon. Ved visuelle kontroller må du huske at øyet er et dårlig spektrometer. Om løsningsfargen kan fastslå renhet er et eget spørsmål med et negativt svar, og fargetoneendringer som skyldes aggregering, er én av grunnene.

Et diagram å ha ved siden av instrumentet

Figuren nedenfor sammenfatter artikkelen i én referanse til bruk på laboratoriebenken. Tre løsninger inneholder samme fargestoff, men har ulik totalkonsentrasjon og saltbakgrunn. De skjematiske spektrene viser at monomerbåndet ved lang bølgelengde mister andel til dimerbåndet ved kortere bølgelengde når stablingen øker. Betingelsene er angitt på figuren fordi kurvene ikke kan gjenbrukes uten dem. Bruk spektralreferansen for målte båndposisjoner under oppgitte betingelser. For hvordan fargestoffet kommer inn i celler når det er i løsning, se celleopptak gjennom reduksjon og fordeling. For hvordan lysdose og geometri ytterligere påvirker fotokjemiske måleresultater, se lyseksponering og målegeometri.

Huskeregelen har to deler. Spekteret identifiserer blandingen som finnes i kyvetten under de oppgitte betingelsene. Bare en kalibrering etablert under de samme betingelsene kan omregne en absorbans til en totalkonsentrasjon.