Alternativer til metylenblått for mikroskopi

For et enkelt bakterieutstryk kan krystallfiolett erstatte metylenblått når målet er å se celleformen. For levende celler kan et bedre alternativ være fasekontrast helt uten farging. Valget avhenger av observasjonen du trenger å gjøre.

Tenk deg at to personer undersøker den samme bakteriekulturen. Den ene ønsker å skille stavformede celler fra runde celler. Den andre ønsker å vite om en behandling har drept bakteriene. En farging som gir den første personen et tydelig bilde, kan gi den andre personen et svar som ikke kan brukes.

Før du velger en erstatning, fullfør denne setningen: «Jeg trenger å observere ___ i ___, og cellene må / trenger ikke å forbli levende.» Den setningen definerer oppgaven fargingen må løse.

Start med preparatet og spørsmålet

Avgjør først om cellene må forbli levende, og identifiser deretter egenskapen du trenger å observere:

Cellene må forbli levende: For bevegelse eller form kan du vurdere ufarget fasekontrast eller DIC; for DNA i cellekjernen kan du vurdere Hoechst 33342 med fluorescens; for membranintegritet bør du velge en validert analyse som SYTO 9 med propidiumjodid.
Cellene trenger ikke å forbli levende: For bakteriell morfologi kan du vurdere enkel farging med krystallfiolett eller negativ farging med nigrosin; for Gram-reaksjon bruker du den komplette Gram-fargingsmetoden; for DNA i cellekjernen i fikserte celler kan du vurdere DAPI-fluorescens.

Bruk denne tabellen til å sammenligne begrensningene i hver gren. Dette er metodevalg, ikke instruksjoner om å bytte flasker i en eksisterende protokoll.

Hva du trenger å observere	Preparat og utstyr	Mulig alternativ	Hovedbegrensning
Bakterieform og -arrangement	Preparert bakterieutstryk; lysfelt	Enkel farging med krystallfiolett	Viser morfologi; fastslår ikke Gram-reaksjon eller levedyktighet.
Cellekonturer mot mørk bakgrunn	Bakteriologisk preparat; lysfelt	Negativ farging med nigrosin	Preparering og formulering har betydning; en ufarget celle er ikke nødvendigvis levende.
Gram-reaksjon	Preparert bakterieutstryk; lysfelt	Komplett Gram-fargingsmetode	Krever hele reagenssekvensen og kontroller.
Bevegelse eller endringer i levende celler	Kompatibelt våtpreparat; fasekontrast eller DIC	Ingen farging	Krever egnet optikk; kontrast identifiserer ikke et molekyl.
DNA i cellekjernen	Fikserte celler; fluorescens	DAPI	Krever kompatible eksitasjons- og emisjonsfiltre.
DNA i cellekjernen i levende celler	Levende celler; fluorescens	Hoechst 33342	Opptak i cellen fastslår ikke at avbildningsforholdene er ufarlige.
Bakteriell membranintegritet	Ikke-fikserte bakterier; fluorescens	SYTO 9 med propidiumjodid	Membranfarging er et indirekte mål på levedyktighet.

For et enkelt utstryk bør metoden erstattes med omtanke

Krystallfiolett er et praktisk alternativ når oppgaven er å få et ensfarget bilde av bakteriell morfologi. FDAs Bacteriological Analytical Manual oppgir to formuleringer med krystallfiolett som er egnet for enkel farging. Bruk en dokumentert formulering og tilhørende prepareringsmetode; navnet på fargestoffet alene spesifiserer ikke et bruksklart reagens.

Krystallfiolett inngår også i Gram-farging, men det gjør ikke en enkel farging med krystallfiolett til en Gram-farging. I ASMs Gram-fargingsprotokoll avhenger differensieringen av at krystallfiolett, jod, avfarging og kontrastfarging virker i sekvens. Hvis disse trinnene utelates, endres hva bildet kan fastslå. Se enkel farging sammenlignet med Gram-farging for denne forskjellen.

Nigrosin gir en annen måte å synliggjøre konturer på: bakgrunnen blir mørkere, mens bakteriecellene forblir relativt lyse. Det finnes en nyttig detalj i Mercks instruksjoner for nigrosin som en generell liste over erstatninger kan overse. Den angitte bruksformuleringen inneholder formaldehyd. Du kan derfor ikke slutte at metoden er kompatibel med levende celler bare ut fra ordene «negativ farging», selv om selve cellene fremstår som ufargede. Kontroller hele formuleringen og prepareringen av prøven.

For levende preparater bør du vurdere å endre optikken

Hvis du ønsker å følge med på at celler beveger eller deler seg, kan et nytt fargestoff komplisere observasjonen. Som Nikon forklarer i sin veiledning om kontrast i transparente preparater, gjør fasekontrast og differensiell interferenskontrast, eller DIC, preparater synlige gjennom forskjeller i deres optiske egenskaper. Metodene kan synliggjøre levende, ufargede celler, forutsatt at mikroskopet har de nødvendige komponentene.

Dette valget bevarer et ufarget preparat, men endrer hvilken informasjon som er tilgjengelig. Du kan følge en cellegrense eller en bevegelse uten å vite hvilket molekyl som skapte kontrasten. Hvis spørsmålet gjelder molekylær lokalisering, bør du i stedet velge en egnet merkingsmetode.

For DNA i cellekjernen skiller Invitrogens sammenligning av DAPI- og Hoechst-farginger mellom vanlig bruk av DAPI med fikserte celler og det mer cellepermeable Hoechst 33342, som foretrekkes til merking av levende celler. Begge krever fluorescensutstyr. Ingen av dem er en direkte erstatning for en farget lysfeltfarging.

Behandle eksponering for fargestoff og belysning som forsøksbetingelser. Sammenlign fargede og ufargede preparater når cellenes atferd er det du måler.

En rød celle er ikke automatisk en død celle

SYTO 9 og propidiumjodid brukes ofte sammen for å vurdere bakteriell membranintegritet. BacLight-manualen forbinder intakte membraner med grønn farging og skadde membraner med rød farging. Denne tolkningen må valideres for det aktuelle preparatet.

En studie fra 2019 av Rosenberg og kolleger illustrerer problemet. I 24-timers E. coli-biofilmer på glass i fosfatbufret saltvann fremsto omtrent 96% av cellene som propidiumjodid-positive in situ. Likevel anslo forfatterne at 82% var dyrkbare etter innsamling. Konfokale bilder viste celler med grønne indre områder under rødfarget materiale, noe som pekte mot ekstracellulære nukleinsyrer som årsak til det misvisende signalet.

Disse prosentandelene beskriver ulike målinger på preparatene i studien, ikke en universell korreksjonsfaktor. Den nyttige lærdommen er å kontrollere hva som genererte signalet. I en biofilm kan et nukleinsyrefargestoff påvise materiale utenfor cellene så vel som inne i skadde celler. For en konklusjon om levedyktighet anbefaler forskerne supplerende målinger, som dyrking eller metabolsk aktivitet, samtidig som de erkjenner at hver metode har begrensninger.

Kontroller hva alternativet faktisk inneholder

En alternativ fargingsmetode kan fortsatt inneholde metylenblått. Giemsa er et eksempel: Merck beskriver produktet sitt som en azure-eosin-methylene-blue solution, beregnet på bruksområder som blant annet blod- og benmargsutstryk. Det kan være en annen metode for et annet preparat, men det oppfyller ikke et krav om å utelukke metylenblått.

Hvis det å utelukke en forbindelse er en del av forsøket, bør du kontrollere reagensets identitet og formulering før du sammenligner bilder. Veiledningen om methyl blue, methylene blue og fargestoffer med lignende navn forklarer forskjellene i navn.

Verifiser erstatningen før du bruker resultatet

For en ny metode bør du gjennomføre en liten sammenligning med representative preparater og en egnet kontroll. Hold mikroskopinnstillingene sammenlignbare der det er mulig. Registrer reagensformulering, preparering av prøven, eksponering og avbildningsforhold, slik at et bilde som ser bedre ut kan undersøkes nærmere i stedet for bare å foretrekkes.

Vurder resultatet opp mot det opprinnelige spørsmålet. For morfologi bør du vurdere om cellegrenser og arrangement fortsatt kan tolkes. For kjernemerking bør du vurdere signalets plassering og bakgrunn. For levedyktighet bør du kreve dokumentasjon utover en visuelt tydelig fargeseparasjon. Den bredere veiledningen om farging med metylenblått og laboratorieanvendelser forklarer hvordan observasjonen og prepareringen henger sammen.

Velg alternativet som bevarer målingen du trenger. Farge er bare én egenskap ved det resulterende bildet.