Kif il-blu tal-metilen jidħol fiċ-ċelloli: riduzzjoni, riossidazzjoni, u qsim bejn il-fażijiet fil-membrana

Jekk tosserva dixx ta’ ċelloli endoteljali jassorbu l-blu tal-metilen, l-interpretazzjoni ovvja tkun ukoll dik żbaljata. Il-medium jitlef il-kulur blu tiegħu, iċ-ċelloli jiksbu granuli blu, allura l-kolorant bilfors għadda mill-membrana bħala l-molekula blu. L-esperimenti jgħidu mod ieħor. Il-forma blu bilkemm tgħaddi. Dik li tgħaddi hija l-forma bla kulur, u l-blu li tara ġewwa jinħoloq ġewwa, wara li jasal.

Din l-inverżjoni hija importanti għax tiddetermina x’jista’ u x’ma jistax jgħidlek it-tinġib. Il-granuli blu jindikaw kolorant ossidat li ġie riossidat u maqbud fl-organelli. Ma jindikawx il-kolorant totali fiċ-ċellola, ma jindikawx l-ammont fil-forma ridotta, u ma jkejlux l-effett bijoloġiku. Biex tifhem għaliex, segwi t-tliet passi: riduzzjoni fil-wiċċ, diffużjoni tal-forma ridotta, riossidazzjoni u qbid ġewwa.

Iż-żewġ forom iġibu ruħhom bħal molekuli differenti

Il-blu tal-metilen ossidat huwa sistema ċatta ta’ ċrieki b’ċarġ pożittiv. Jinħall fl-ilma, jassorbi d-dawl b’mod qawwi madwar 600 sa 700 nanometers, u jidher blu. Iċ-ċarġ huwa l-punt ewlieni. Molekula ċċarġjata li għandha affinità għall-ilma ma tgħaddix faċilment minn membrana lipidika, għalhekk il-frażi preċiża fil-letteratura hija relattivament impermeabbli għall-membrana, mhux impermeabbli.

Il-blu tal-metilen ridott, imsejjaħ lewkometilen blu, huwa bla kulur, bla ċarġ, u jinħall fix-xaħam. Neħħi ċ-ċarġ u l-membrana ma tibqax ħajt. Il-molekula ridotta tgħaddi faċilment bid-diffużjoni, u ladarba tkun f’kompartiment aktar ossidanti tista’ terġa’ titlef l-elettroni u terġa’ lura għall-forma blu, iċċarġjata u maqbuda. Għalhekk, il-kimika redox tal-kolorant hija wkoll il-mekkaniżmu tat-trasport tiegħu. Ibdel l-għadd tal-elettroni u tibdel il-permeabbiltà.

L-elettroni għall-ewwel pass jiġu miċ-ċellola stess. Iċ-ċelloli tal-mammiferi jwettqu trasport tal-elettroni minn naħa għall-oħra tal-membrana plażmatika, billi jmexxu ekwivalenti riduċenti minn donaturi intraċellulari lejn aċċettaturi fil-wiċċ. Din l-attività minn naħa għall-oħra tal-membrana plażmatika hija funzjoni normali taċ-ċellola, li tinstab fil-biċċa l-kbira tat-tipi ta’ ċelloli, u r-riduttażi tal-wiċċ endoteljali li taġixxi fuq il-koloranti tat-tijażina ġġib ruħha bħal oħrajn f’aspett wieħed sinifikanti: tibqa’ taħdem fil-preżenza taċ-ċjanur u l-ażid f’dożi li jwaqqfu l-passi ta’ wara. Din is-separazzjoni hija l-qofol tal-istorja kollha.

Il-qsim bejn il-fażijiet ġie l-ewwel, u kważi spjega l-assorbiment

Fl-1929, Marian Irwin fl-Istitut Rockefeller staqsiet mistoqsija aktar sempliċi. Forsi d-dħul tal-kolorant huwa biss qsim bejn l-ilma u s-saffi xaħmin taċ-ċellola, u saff ta’ kloroform jista’ jirrappreżenta dawk is-saffi xaħmin fuq il-bank tal-laboratorju. Fl-istudji spettrofotometriċi tagħha dwar il-penetrazzjoni, ħawdet soluzzjonijiet milwiema tal-kolorant mal-kloroform u qabblet dak li għadda fil-fażi organika ma’ dak li daħal fiċ-ċelloli ħajjin tal-alka.

Żewġ sejbiet minn dak ix-xogħol għadhom jistħoqqilhom attenzjoni. L-ewwel, is-soluzzjonijiet kummerċjali tal-blu tal-metilen kien fihom trimetil tijonina, li llum tissejjaħ azure B, u din l-impurità ppenetrat aktar malajr mill-blu tal-metilen innifsu, speċjalment f’pH alkalin fejn tiddomina l-forma ta’ bażi ħielsa li tinħall fil-lipidi. Xi dħul li deher li kien tal-blu tal-metilen kien fil-fatt dħul selettiv ta’ azure B. It-tieni, il-pH iddetermina r-riżultat billi ddetermina l-istat tal-jonizzazzjoni, u ċ-ċelloli danneġġati ħallew jidħol ħafna aktar kolorant minn dawk intatti. Il-koeffiċjenti tal-qsim bejn il-fażijiet u l-istat taċ-ċarġ ikkontrollaw dak li assorbew kemm is-sistema artifiċjali kif ukoll iċ-ċellola ħajja, u x-xebh bejniethom appoġġa l-idea ta’ saffi mhux milwiema fil-konfini taċ-ċellola.

Il-mudell antiċipa l-importanza tal-lipidi u l-jonizzazzjoni, iżda ma setax jiddistingwi bejn kolorant li jinqasam bejn il-fażijiet mingħajr ma jinbidel u kolorant li jiġi kkonvertit kimikament fil-wiċċ, jgħaddi f’forma differenti, u jerġa’ jiġi kkonvertit ġewwa. Dik id-distinzjoni kienet teħtieġ esperiment differenti, u dan wasal sebgħin sena wara fl-endotelju tal-pulmun.

Riduzzjoni barra, qbid ġewwa

Merker u l-kollegi tiegħu ħadmu b’ċelloli endoteljali tal-arterji pulmonari bovini kkultivati u pproponew sekwenza ta’ tliet passi: il-kolorant ossidat jiġi ridott fuq il-wiċċ taċ-ċellola għall-forma lipofilika tiegħu bla kulur, il-forma ridotta tidħol bid-diffużjoni, u r-riossidazzjoni intraċellulari tirriġenera l-forma ossidata impermeabbli għall-membrana, li takkumula. L-istudju tagħhom dwar l-assorbiment endoteljali tat-tijażina imbagħad ittestja s-sekwenza billi pprova jinterrompiha f’punti speċifiċi.

L-ewwel għodda kienet il-ferriċjanur, aċċettatur tal-elettroni li ma jistax jidħol fiċ-ċellola. Meta l-enzimi tal-wiċċ jirriduċu l-kolorant blu għall-forma tiegħu bla kulur barra ċ-ċellola, il-ferriċjanur jista’ jieħu lura dawk l-elettroni, u jirriġenera l-kolorant blu fil-medium qabel ma dan ikun għadda mill-membrana. Sakemm il-ferriċjanur kien preżenti f’eċċess (10 micromolar ta’ kolorant kontra 50 sa 500 micromolar ta’ ferriċjanur), l-assorbiment tal-kolorant kważi waqaf, u kien biss wara li ġie kkunsmat il-ferriċjanur li l-assorbiment reġa’ beda bir-rata normali tiegħu. Il-kinetika tat l-istess spjegazzjoni b’mod ieħor. Il-ferriċjanur għeb b’rata bejn wieħed u ieħor kostanti, konsistenti ma’ fluss kostanti ta’ riduzzjoni fil-wiċċ li jsostni medjatur li jista’ jiġi riċiklat, filwaqt li l-kolorant barra ċ-ċellola għeb b’mod esponenzjali hekk kif l-ammont disponibbli tiegħu naqas. Fluss kostanti flimkien ma’ ammont li qiegħed jonqos ifisser li s-sinjal tal-ferriċjanur jindika riduzzjoni kontinwa, mhux molekuli tal-kolorant li qegħdin jitilqu mis-soluzzjoni.

It-tieni għodda neħħiet għal kollox il-pass tal-qsim tal-membrana. Il-grupp rabat il-blu tat-toluwidina O, qarib tat-tijażina, ma’ katina kbira tal-poliakrilammid li kienet kbira wisq biex tidħol fiċ-ċellola fi kwalunkwe wieħed miż-żewġ stati ta’ ossidazzjoni. Iċ-ċelloli xorta rriduċew il-kolorant marbut. Għalhekk, ir-riduzzjoni ma teħtieġx aċċess intraċellulari. Il-makkinarju huwa espost fil-wiċċ jew akkoppjat elettrikament miegħu.

Imbagħad waslet is-separazzjoni li tat lill-artiklu t-titlu tiegħu. Iċ-ċjanur u l-ażid f’2 millimolar rażżnu b’mod qawwi l-akkumulazzjoni tal-kolorant, u taħt il-mikroskopju l-inklużjonijiet blu skur u vjola li normalment jiċċirkondaw in-nukleu kważi għebu. Madankollu, l-ebda wieħed miż-żewġ inibituri ma naqqas ir-rata tar-riduzzjoni ekstraċellulari: iċ-ċiklu tal-ferriċjanur kompla mingħajr tnaqqis u l-polimeru li ma jgħaddix mill-membrana xorta ġie ridott. L-imblukkar kien f’pass aktar tard. Iċ-ċjanur u l-ażid kienu qegħdin iwaqqfu r-riossidazzjoni u s-sekwestrazzjoni intraċellulari, mhux ir-riduzzjoni fil-wiċċ. Il-kontrolli tal-vijabbiltà appoġġaw din l-interpretazzjoni, peress li ċ-ċelloli żammew l-enzima markatriċi ċitosolika tagħhom, il-lattat deidroġenażi, matul dawn it-trattamenti, u għalhekk it-telf tal-assorbiment ma kienx sempliċement riżultat ta’ avvelenament jew ksur tal-membrana.

Twissija waħda mill-artiklu għadha tapplika. L-inklużjonijiet blu kienu madwar in-nukleu iżda mhux fih, konsistenti ma’ ossidazzjoni ġewwa organelli subċellulari, iżda l-istudju ma identifikax liema organelli. Xejriet simili f’tipi oħra ta’ ċelloli kienu ġew deskritti bħala liżosomali fuq evidenza dgħajfa. Qis il-qbid bħala stabbilit u l-post tiegħu bħala proviżorju. Il-qarrejja li qegħdin isegwu fejn imorru l-elettroni wara jistgħu jkomplu bit-trasport tal-elettroni fil-mitokondriji u l-proċessi redox u l-istampa usa’ tal-assorbiment u d-distribuzzjoni skont ir-rotta.

It-tinġib mhuwiex l-espożizzjoni

It-tielet studju juri x’jiġri meta din il-loġika tal-assorbiment tiltaqa’ ma’ kejl bijoloġiku. Scott u l-kollegi tiegħu sabu li l-metil beta ċiklodestrina, zokkor b’forma ta’ torojde, tintrabat direttament mal-blu tal-metilen, b’kostanti ta’ assoċjazzjoni ta’ madwar 310 per molar għall-kumpless ta’ inklużjoni, meta mqabbla ma’ madwar 5846 per molar għad-dimerizzazzjoni tal-kolorant. Fil-fibroblasti L929, dan l-irbit imblokka kemm it-tinġib taċ-ċelloli kif ukoll l-istimulazzjoni tal-assorbiment tal-glukożju: preinkubazzjoni biċ-ċiklodestrina ppreveniet it-tinġib bil-blu, u ż-żieda tagħha wara aċċellerat it-tneħħija tal-kulur. Hekk kif is-sinjal ottiku blu ħareġ miċ-ċelloli, it-trasport attivat tal-glukożju naqas b’mod strettament parallel.

L-awturi interpretaw din il-korrelazzjoni bħala li tiffavorixxi interazzjoni diretta bejn il-kolorant u proteina fil-mogħdija tal-attivazzjoni tat-trasportatur tal-glukożju, aktar milli mekkaniżmu fit-tul ta’ stress ossidattiv. Dik l-inferenza hija raġonevoli iżda limitata. L-esperiment ma jidentifikax il-proteina, ma jurix irbit mat-trasportatur innifsu, u l-korrelazzjoni bejn it-tneħħija tal-kulur u t-telf tal-effett ma tistax teskludi kull mogħdija medjata minn proċessi redox.

Il-lezzjoni li tibqa’ tgħodd hija dwar il-kejl. It-tinġib ottiku jindika kolorant viżibbli, ossidat u assoċjat maċ-ċelloli. Ma jaqbad xejn mill-ammont fil-forma ridotta bla kulur, għalhekk ċellola pallida xorta jista’ jkollha ekwivalenti tal-kolorant, u ċellola miżbugħa b’mod qawwi tindika kolorant ossidat maqbud aktar milli l-espożizzjoni totali tat-tessut jew il-kobor tal-effett. L-istess twissija tapplika fuq skala akbar: it-tqabbil tat-tinġib bejn tipi ta’ ċelloli, jew it-trattament ta’ sezzjoni skura ta’ tessut bħala prova ta’ espożizzjoni ogħla, jirrepeti l-iżball oriġinali tad-dixx. L-assorbiment huwa ċiklu ta’ riduzzjoni, diffużjoni u riossidazzjoni, u kwalunkwe stampa waħda tal-forma blu tara biss parti waħda minnu. Il-konsegwenzi prattiċi għat-tinġib u l-immaniġġjar fil-laboratorju u għall-interpretazzjoni ta’ affermazzjonijiet dwar id-doża u l-espożizzjoni joħorġu direttament minn dan.