Siapakah yang membangunkan pewarna darah ungu? Metilena biru, Malachowski, Romanowsky dan Giemsa

Eosin berwarna merah. Metilena biru berwarna biru. Campurkan kedua-duanya, sapukan campuran itu pada filem darah yang telah dikeringkan, dan sebahagian filem itu menjadi ungu.

Bukan setiap bahagian. Dalam sediaan yang baik, nukleus sel darah putih menjadi merah-ungu, dan kromatin di dalam parasit malaria mengambil warna yang sama, manakala sel darah merah di sekelilingnya kekal merah jambu dan sitoplasma kekal kelabu-biru. Warna ungu itulah yang membolehkan jenis-jenis sel dibezakan.

Tiada satu pun botol itu mengandungi warna ungu. Warna itu hanya muncul apabila suatu hasil penguraian tertentu daripada metilena biru bertemu dengan eosin pada slaid, dan pada 1880-an dan 1890-an, tiada siapa tahu bahawa hasil itu wujud, apatah lagi mengetahui identitinya. Mereka yang mencari warna itu bekerja sendirian dengan pewarna tidak tulen, tanpa cara yang boleh dipercayai untuk mengetahui kandungan botol selepas botol itu tersimpan di atas rak selama dua bulan.

Itulah sebabnya soalan dalam tajuk mempunyai lebih daripada satu jawapan yang munasabah, dan sebabnya jawapan itu berubah pada 2011.

Hasil pemerhatian yang berubah mengikut campuran

Pewarna itu bukan dicipta sekali gus. Ia terbentuk melalui penambahan demi penambahan. Setiap perubahan pada campuran menghasilkan tepat satu maklumat baharu yang dapat dilihat, dan urutan maklumat tersebut ialah cara paling jelas untuk memahami sejarahnya.

Corak dalam lajur terakhir itulah yang penting. Setiap kemajuan meluaskan julat warna, dan setiap peluasan menampakkan satu lagi struktur. Warna ungu bukan sekadar hiasan pada teknik itu; itulah perbezaan antara melihat bahawa parasit wujud dengan melihat struktur yang membentuknya. Bagaimana pewarna itu sendiri berpindah daripada kilang pewarna BASF ke bidang perubatan merupakan sejarah yang lebih panjang dengan dokumennya sendiri. Urutan penuh di atas, berserta sumber bagi setiap entri, disimpan sebagai garis masa penyumbang dengan pautan sumber.

Rajah: enam campuran yang sama digambarkan berdasarkan kandungan bekas dan hasilnya. Bulatan menunjukkan pewarna; blok di bawahnya menunjukkan warna yang dapat dihasilkan oleh pewarna tersebut pada filem darah. Tiada campuran sebelum 1890 yang mempunyai blok merah-ungu, dan semua campuran selepasnya mempunyai blok itu.

Lelaki yang sengaja menggunakan boraks

Ernst Malachowski ialah seorang doktor di Breslau, kini Wrocław, yang menghabiskan kerjayanya dalam amalan perubatan swasta dan di sebuah klinik kecil yang dikendalikannya bersama seorang rakan sekerja, sambil melakukan kerja makmal pada waktu lapang. Beliau dilahirkan di Strzelno pada 12 Mac 1857, belajar perubatan di Universiti Breslau, dan bekerja dari 1882 hingga 1887 sebagai pembantu dalam bidang perubatan dalaman di Hospital All Saints, yang ketika itu merupakan hospital kedua terbesar di Jerman.

Beliau bermula pada 1888 dengan pewarnaan berganda Chęciński dan Plehn. Dalam sediaan yang dibuat pada 1889, beliau melihat kromatin nukleus plasmodium terwarna secara berbeza daripada sitoplasma, tetapi kemudian mendapati bahawa beliau tidak dapat menghasilkan semula hasil itu. Beliau cuba mengasidkan metilena biru, tetapi hal itu memburukkan keadaan. Beliau cuba menjadikannya beralkali dengan boraks, dan cara itu berjaya setiap kali. Beliau menunjukkan kaedah tersebut kepada umum pada 15 Jun 1890 dan menerbitkan penerangan yang lebih lengkap pada Ogos 1891, termasuk arahan penggunaan boraks. Beliau mencatatkan bahawa pewarnaan itu mengambil masa dua puluh empat jam dan hasilnya mudah dihasilkan semula.

Dua puluh empat jam ialah tempoh yang lama dalam makmal diagnostik, dan makalahnya tidak menghuraikan panjang lebar warna ungu-merah pada nukleus parasit. Walau apa pun sebabnya, tiada siapa meneruskan pengalkalian metilena biru secara sengaja sehingga Nocht melakukannya semula pada 1898. Malachowski tidak pernah menulis tentang pewarnaan darah lagi.

Sebab begitu sedikit maklumat tentang beliau diketahui sehingga baru-baru ini berkaitan dengan rekod arkib, bukannya misteri. Hampir tiada jejak kehidupannya yang terselamat dalam literatur perubatan, dan apa yang terselamat datang melalui satu saluran. Anak perempuannya, Marie, meninggalkan Jerman untuk ke London pada 1939, berkhidmat dalam Tentera British, kemudian menetap di Kanada, dan koleksi dokumen keluarganya akhirnya ditempatkan di Institut Leo Baeck di New York. Abangnya, Leo, terbunuh dalam Perang Dunia Pertama. Kakaknya, Eva, dihantar secara paksa dari Breslau ke kem transit Izbica pada April 1942 dan tidak pernah kembali. Ibunya, Hedwig, menamatkan riwayatnya sendiri pada 22 April 1942 daripada menunggu penghantaran paksa yang sama. Malachowski telah meninggal dunia pada 1934, sebelum semua itu berlaku.

Sejarah keluarga yang berakhir sedemikian ialah sejarah keluarga yang tidak lagi dipetik. Dua makalah yang mengembalikan Malachowski ke dalam sejarah pembangunan pewarna itu, kedua-duanya diterbitkan pada 2011, disusun daripada dokumen arkib di Poznań dan Wrocław serta dokumen Marie di New York.

Botol berkulat dan seorang warga Rusia yang bernasib baik

Dmitri Romanowsky belajar perubatan di Akademi Perubatan Tentera di St Petersburg dan mengkaji malaria sepanjang sebahagian besar kerjayanya. Pada 1890, beliau menerbitkan kaedah yang, di atas kertas, hampir sama dengan kaedah Chęciński: metilena biru yang tidak diubah suai bersama eosin, dengan sedikit lebih banyak eosin.

Pada September 1891, beliau menerbitkan kaedah yang mengangkat namanya, dan butiran yang penting terselit dalam arahan. Hasil terbaiknya datang daripada die vorräthige Methylenlösung, larutan stok metilena biru yang telah dibiarkan selama lebih dua bulan dengan kulat tumbuh padanya. Kulat dan tempoh penyimpanan itu telah menyahmetilkan sebahagian pewarna tersebut. Romanowsky tidak mengetahui hal itu dan tidak dapat mengawalnya, dan penyelidik lain yang mencuba kaedahnya tidak dapat menghasilkan warna ungu. Tesisnya telah diserahkan di St Petersburg pada Jun 1891, sebab itulah kisah yang lazim diterima menganggap 1891 sebagai tahun penemuan.

Demonstrasi Malachowski telah berlangsung pada Jun 1890, lebih setahun sebelumnya, dan kaedahnya berfungsi secara sengaja.

Mengapa nama orang yang salah diabadikan

Hujah yang menyokong Malachowski disusun oleh Kristine Krafts, Ernst Hempelmann dan Barbara Oleksyn, dan bersandar pada empat perkara. Tarikh demonstrasi awam, Jun 1890 berbanding September 1891. Perkataan sengaja berbanding kebetulan. Hakikat bahawa Malachowski menerbitkan kaedahnya, lengkap dengan boraks, sedangkan kaedah Romanowsky bergantung pada pemboleh ubah yang tidak terkawal. Dan pemerhatian bahawa penerangan tentang nukleus plasmodium, bersama warna ungu yang menampakkannya, pada hakikatnya hilang daripada literatur selama tujuh tahun kerana tiada siapa dapat menghasilkan semula versi yang terhasil secara kebetulan itu.

Mereka menyatakan kesimpulannya dengan tegas. Dalam makalah biografi itu, mereka menyifatkan pemberian pengiktirafan tersebut sebagai "suatu pencabulan keadilan", dan memetik Ralph Lillie, yang pada 1978 menulis bahawa "mungkin kita patut merujuk kepada keluarga pewarna ini sebagai pewarna Malachowski".

Tuntutan itu dipertikaikan, sebagaimana lazimnya tuntutan tentang siapa yang mendahului sesuatu penemuan, dan bentuk pertikaian itu wajar dijelaskan, bukan diputuskan. Hujah tentang keutamaan penemuan perlu menyatakan apakah penemuan itu. Jika penemuannya ialah warna ungu, Malachowski mempunyai demonstrasi terdokumen yang lebih awal. Jika penemuannya ialah kaedah yang diterbitkan, kedua-dua lelaki itu menerbitkan kaedah pada 1891 dan nama Romanowsky yang diabadikan. Jika penemuannya ialah penjelasan, kedua-duanya tidak boleh menuntutnya, kerana kedua-duanya tidak tahu bahawa pematangan itu ialah penyahmetilan dan kedua-duanya tidak dapat menjelaskan mengapa warna itu muncul. Perkara terakhir itulah yang diabaikan oleh kisah-kisah popular. Bahan aktifnya ialah bendasing yang belum dikenal pasti oleh sesiapa, dan orang pertama yang menghasilkan warna itu dengan sengaja melakukannya berdasarkan resipi empirikal yang boleh diulangi, bukan berdasarkan pemahaman tentang apa yang dilakukan oleh resipi itu.

Dua makalah pada 2011 itu merupakan hujah terbitan paling lengkap yang menyokong Malachowski, dan kedua-duanya boleh dibaca secara percuma di PubMed: ulasan panjang di PMID 21235291 dan makalah biografi di PMID 21660627. Rekod PubMed bagi ulasan itu turut menyenaraikan satu ulasan balas mengenainya, yang diterbitkan dalam jurnal yang sama pada penghujung tahun tersebut di 86(5):366, sebagai peringatan yang wajar bahawa hujah itu dipertikaikan dalam penerbitan sebaik sahaja ia muncul.

Pertikaian itu bukanlah perbezaan pendapat tentang kimia. Semua pihak yang terlibat bersetuju tentang apakah warna ungu itu dan komponen mana yang menghasilkannya. Perbezaan pendapatnya ialah tentang siapa yang mencapainya dahulu, dan sama ada hasil kebetulan yang tidak dapat diulangi oleh sesiapa boleh dianggap sebagai pencapaian itu sama sekali.

Sumbangan nama-nama yang muncul kemudian

Jika Malachowski menghasilkan warna ungu dahulu, mengapa pewarna itu membawa nama Romanowsky, Wright dan Giemsa?

Kerana pewarna yang hanya berjaya sekali di tangan penciptanya bukanlah reagen. Kerja yang dilakukan kemudian mengubah campuran yang sukar dijangka menjadi sesuatu yang boleh digunakan oleh juruteknik di negara lain pada hari Selasa.

Nocht mencapainya melalui penaakulan. Selepas gagal mendapatkan hasil yang konsisten daripada pewarna neutral ringkas, beliau menyimpulkan bahawa warna ungu mesti datang daripada sesuatu dalam metilena biru yang bukan metilena biru, lalu mencarinya. Unna telah pun menyedari bahawa larutan metilena biru yang lama mewarnakan granul sel mast menjadi merah, dan mencadangkan bahawa suatu bahan baharu terbentuk apabila pewarna itu matang. Bernthsen telah menunjukkan pada 1885 bahawa keadaan beralkali menanggalkan kumpulan metil daripada metilena biru, dan hasil-hasil inilah yang kini kita panggil azure. Nocht mengekstrak fraksi aktif dengan kloroform dan hanya dapat menamakannya Rot aus Methylenblau, merah daripada metilena biru; Michaelis menamakannya azure I pada 1901. Jenner menyelesaikan masalah logistik. Melarutkan semula mendakan metilena biru dan eosin dalam metanol mutlak menghasilkan satu larutan stabil yang memfiksasi filem sambil mewarnakannya, lalu menamatkan keperluan fiksasi haba. Leishman dan Reuter menggabungkan pewarna yang telah dipolikromkan dengan pelarut beralkohol dan memperoleh kestabilan serta warna ungu sekali gus. Wright menggantikan pengeraman selama dua belas jam pada 65 °C dan tempoh dibiarkan selama sepuluh hari dengan satu jam dalam aliran wap. Giemsa langsung tidak lagi bergantung pada larutan yang matang secara rawak, sebaliknya menggunakan kuantiti pewarna yang diketahui dan diukur, bersama gliserol dalam metanol supaya produk itu tahan haba tropika. Beliau tidak pernah menerbitkan cara beliau menghasilkan metilena azure tulen. Beliau menjualnya kepada makmal Dr Grübler di Leipzig, yang memasarkannya sebagai azure I dan mendakwa bahawa hanya versinya merupakan pewarna Giemsa yang asli.

Identiti azure itu masih diperdebatkan. Sesetengah pihak berpendapat bahawa ia sekadar metilena biru yang telah dipolikromkan, manakala yang lain berpendapat bahawa ia kaya dengan Azure B. Jawapannya muncul akibat perang. Apabila pewarna Jerman tidak lagi dapat diperoleh, satu pasukan Perkhidmatan Kesihatan Awam Amerika Syarikat, iaitu Ralph Lillie bersama Maurice Roe dan Aimee Wilcox, mendapati bahawa pewarnaan terbaik datang daripada tiga komponen yang diasingkan: metilena biru yang tidak diubah suai, hasil penguraian ternyahmetilnya iaitu Azure B, dan eosin. Azure B menggantikan azure I yang tidak lagi tersedia, dan ketiga-tiga komponen itu masih menjadi asas pewarna yang digunakan untuk mendiagnosis malaria hari ini.

Kimia tentang bagaimana ketiga-tiga komponen itu berinteraksi pada slaid ialah persoalan berasingan yang dibincangkan pada halaman lain. Halaman peranan pewarna dan kimia pewarna jenis Romanowsky menerangkan fungsi Azure B dan eosin masing-masing, serta sebab pasangan itu menghasilkan warna yang tidak dapat dihasilkan oleh salah satu daripadanya secara bersendirian. Halaman mikroskopi dan aplikasi makmal pula membincangkan aspek praktikal: apa yang ditunjukkan oleh sesuatu sediaan, dan bagaimana menilai sama ada sesuatu produk sesuai untuk kaedah yang anda ingin gunakan.

Bahagian sejarah yang masih relevan

Satu butiran dalam kisah ini masih benar selepas 1902. Selama kira-kira lima puluh tahun, komponen paling penting dalam pewarna malaria standard dunia ialah bendasing yang tidak bernama. Ia hadir secara kebetulan, kuantitinya berbeza antara botol, identitinya menjadi rahsia perdagangan untuk sebahagian tempoh itu, dan nisbahnya diperdebatkan sehingga 1940-an. Mereka yang menggunakan pewarna itu bukan cuai. Mereka tidak mempunyai cara untuk mengetahui kandungan botol.

Bentuk moden bagi masalah yang sama ialah spesifikasi yang hanya menerangkan sebahagian daripada bahan. Pematuhan USP ialah jalan menuju ketulenan tertinggi yang ditawarkan oleh pasaran, kerana ia merupakan piawaian lengkap yang diterbitkan, bukannya satu ukuran sahaja: identiti, ketulenan, bendasing organik termasuk pewarna azure, baki pelarut, bendasing unsur, residu selepas pembakaran, had mikrob dan endotoksin bakteria. Blupreme memperoleh metilena birunya daripada pengilang farmaseutikal dan menerbitkan sijil analisis penuh, supaya setiap butiran dalam senarai itu boleh disemak, bukan sekadar didakwa. Sijil yang melaporkan keputusan ujian logam berat dan menyebutnya sebagai pematuhan USP ialah padanan masa kini bagi botol berlabel "metilena biru yang dimatangkan": mungkin reagen yang baik, tetapi label itu tidak memberitahu anda kandungannya.