Metilena biru untuk pewarnaan DNA dan RNA: aplikasi gel dan membran

Seorang pelajar menjalankan elektroforesis gel agarosa, mewarnainya dengan metilena biru, tetapi tidak melihat apa-apa di tempat jalur terang dijangka muncul. Di ruang kerja bersebelahan, seorang penyelidik pascadoktoral mewarnai membran Northern menggunakan botol biru yang sama dan memperoleh jalur ribosom yang jelas dalam tiga minit. Pelajar itu menyimpulkan bahawa gel tersebut gagal. Gel itu tidak gagal. Kedua-dua tugas itu berbeza, dan pewarna yang sama memenuhi keperluan masing-masing dengan kepekaan, latar belakang dan peraturan proses susulan yang berbeza.

Pewarnaan DNA dan pewarnaan RNA dengan metilena biru berkongsi asas kimia, tetapi bukan tujuan. Dalam gel, pewarna menunjukkan jumlah asid nukleik di dalam matriks berliang. Pada membran, pewarna menunjukkan sama ada pemindahan berjaya dan sama ada lorong dimuatkan secara sekata. Setelah perbezaan itu jelas, protokol, had pengesanan dan had keserasian menjadi lebih mudah difahami.

Jawapan ringkas

Metilena biru ialah pewarna kationik planar yang mengikat asid nukleik secara bukan kovalen dan boleh balik, melalui gabungan tarikan elektrostatik kepada fosfat, interkalasi antara pasangan bes dan pengikatan pada alur kecil. Sifat boleh balik itulah yang penting. Jalur boleh diwarnai untuk dilihat dengan cahaya tampak, didokumentasikan, kemudian dinyahwarna atau dimurnikan untuk pengklonan, hibridisasi atau pengesanan semula dengan prob.

Untuk pewarnaan DNA dwibebenang dalam gel agarosa dengan metilena biru, formulasi pantas standard ialah 0.02 percent w/v (200 micrograms per mL) dalam air, dengan kira-kira 15 minit pewarnaan diikuti kira-kira 15 minit penyahwarnaan menggunakan air, kemudian dilihat pada kotak cahaya putih. Untuk membran, formulasi klasik blot Northern ialah pewarna 0.02 hingga 0.04 percent dalam natrium asetat pada sekitar pH 5.2, dengan pewarnaan selama beberapa minit selepas pemindahan dan imobilisasi, diikuti bilasan air dan penyahwarnaan lengkap sebelum hibridisasi. Kepekaannya sederhana: puluhan hingga ratusan nanogram bagi setiap jalur gel dalam keadaan yang baik, manakala panduan konservatif menyenaraikan 0.5 hingga 1 microgram. Nilai ini beberapa tertib magnitud lebih tinggi daripada etidium bromida dan pewarna SYBR. Pada membran, tiada satu had pengesanan transkrip yang berguna kerana pewarna ini terutamanya menunjukkan RNA ribosom yang banyak dan jumlah bahan yang dimuatkan. Jangan gantikan bahan dalam mana-mana formulasi dengan larutan suplemen runcit. Kaedah yang telah disahkan mengandaikan penggunaan pewarna gred analisis, penimbal yang ditetapkan dan pengendalian bebas RNase apabila RNA terlibat.

Cara pengikatan berlaku, dan bagaimana ia boleh mengelirukan

Model yang berguna ini mempunyai tiga bahagian. Pertama, sistem cincin bercas positif tertarik kepada rangka fosfat bercas negatif. Kajian spektroskopi mendapati komponen elektrostatik ini dominan pada kepekatan garam rendah, manakala pemodelan dan dinamik molekul menunjukkan bahawa interkalasi dan pengikatan pada alur kecil merupakan mod yang stabil bagi DNA dwibebenang, seperti yang diringkaskan dalam kajian spektroskopi tentang pengikatan metilena biru kepada DNA. Kedua, terdapat sedikit kecenderungan terhadap GC, dengan pemodelan memihak kepada langkah CpG dan GpC serta eksperimen melaporkan pengikatan yang lebih cenderung kepada dupleks kaya GC dalam kajian tentang kecenderungan interkalasi metilena biru, tetapi dupleks AT juga mengikat pewarna ini. Pewarnaan rutin tidak khusus kepada jujukan. Ketiga, DNA bebenang tunggal dan RNA mengikat terutamanya melalui interaksi elektrostatik dan penindanan dengan bes yang boleh diakses serta kawasan dupleks. Oleh sebab itu, kekuatan pewarnaan berubah mengikut panjang, jujukan dan struktur sekunder.

Dua kesan menyusul. Oleh sebab pengikatan bukan kovalen, pewarna boleh tersingkir melalui cucian. Jalur poliakrilamida cepat pudar melainkan difiksasi secara sengaja, dan varian fiksasi kekal yang khusus wujud kerana pewarnaan biasa bersifat sementara, seperti yang dihuraikan oleh Soto dan Draper untuk gel PAGE. Oleh sebab pewarna ini ialah pemeka cahaya, pencahayaan terang yang berpanjangan pada DNA yang diwarnai dengan kehadiran oksigen boleh mengoksidakan guanina dan akhirnya menyebabkan takikan pada bebenang. Mekanisme ini diperincikan dalam kajian tentang pengoksidaan guanina yang dipekakan oleh metilena biru. Pemerhatian singkat dengan cahaya putih mengelakkan kerosakan UV yang diketahui dalam aliran kerja klasik etidium bromida, dan kelebihan itu memang berguna untuk pemulihan preparatif. Cahaya tampak lebih lembut, tetapi bukan tanpa risiko. Pendekkan tempoh pencahayaan apabila DNA akan diklonkan. Untuk fotokimia yang lebih luas di sebalik langkah berjaga-jaga itu, lihat dua laluan dalam fotokimia metilena biru. Untuk pasangan redoks dan keadaan cas yang menerangkan mengapa bentuk teroksida mengikat manakala bentuk tereduksi tidak, lihat kimia struktur dan sifat metilena biru.

Tugas pertama: pewarnaan dalam gel

Pewarnaan gel menjawab satu soalan: adakah terdapat cukup asid nukleik dalam jalur ini untuk dilihat dengan mata. DNA dwibebenang dalam agarosa ialah kes yang paling banyak dicirikan. Kaedah gel metilena biru asal oleh Flores dan rakan-rakan mengesahkan protokol pantas 0.02 percent pada agarosa 1 percent dan menunjukkan pemulihan serta pengklonan yang berjaya selepas itu. Protokol pembekal yang sama terdapat pada halaman produk metilena biru IBI Scientific, yang menyenaraikan formulasi membran 0.04 percent dan varian gel pantas secara bersebelahan.

Aliran kerja praktikal:

1. Jalankan elektroforesis gel seperti biasa. Lakukan pewarnaan selepas elektroforesis, bukan semasanya, melainkan pemindahan atau resolusi telah disahkan untuk kaedah yang diubah suai.
2. Rendam dalam metilena biru 0.02 percent w/v dalam air suling, dengan penggoncangan perlahan, selama kira-kira 15 minit.
3. Nyahwarna dengan menggantikan air beberapa kali, selama kira-kira 15 minit keseluruhannya, sehingga warna latar belakang matriks berkurang dan jalur kelihatan jelas.
4. Ambil foto segera pada alat pencahayaan cahaya putih.

Agarosa dan poliakrilamida berkelakuan berbeza. Agarosa mengekalkan pewarna dalam matriks, maka penyahwarnaan ialah langkah yang perlahan. Gel poliakrilamida nipis cepat diwarnai tetapi juga cepat kehilangan pewarna, yang membantu pemotongan preparatif tetapi menyukarkan penyimpanan rekod. Oligonukleotida sintetik dalam poliakrilamida boleh dikenal pasti kedudukannya dengan formulasi 0.02 percent yang sama dalam 20 hingga 30 minit melalui cucian air berulang, mengikut kaedah PAGE gaya Current Protocols yang telah mantap. Varian yang sangat cair, sekitar 0.0002 percent dalam TBE cair, telah dilaporkan untuk oligonukleotida preparatif selama beberapa jam, tetapi asas buktinya lebih lemah.

Perbezaan antara DNA dan RNA penting. DNA dwibebenang memberikan pengikatan berstruktur yang paling kuat. RNA dan DNA bebenang tunggal boleh diwarnai, tetapi pewarnaannya lebih lemah dan kurang dapat diramal. Untuk gel RNA agarosa formaldehid, kebanyakan makmal tidak melakukan pewarnaan biru dalam gel dan sebaliknya memindahkan RNA ke membran terlebih dahulu, kemudian mewarnainya di situ. Langkah itu menggantikan isyarat gel yang lemah dengan isyarat membran yang lebih jelas serta rekod pemuatan.

Tugas kedua: pewarnaan pada membran

Pewarnaan membran menjawab soalan yang berbeza: adakah pemindahan berjaya, dan bolehkah lorong dibandingkan. Aplikasi klasiknya ialah pewarnaan blot Northern boleh balik oleh Herrin dan Schmidt, yang pada asalnya menggunakan pewarna 0.04 percent dalam natrium asetat 50 mM pada pH 5.0 selama 2 hingga 3 minit dengan bilasan air, dan boleh disingkirkan menggunakan SDS cair dalam SSPE sebelum hibridisasi.

Varian moden yang digunakan secara meluas dijalankan seperti berikut:

1. Pindahkan RNA atau DNA ternyahasli ke nilon atau nitroselulosa, kemudian imobilisasikan melalui pemautan silang UV atau pemanasan supaya sampel tidak hilang semasa pewarnaan.
2. Pilihan tetapi lazim: basahkan membran dalam asid asetik 5 percent selama kira-kira 15 minit.
3. Warnai selama 5 hingga 10 minit dalam metilena biru 0.02 hingga 0.04 percent dalam natrium asetat 0.3 hingga 0.5 M pada sekitar pH 5.2.
4. Bilas dan nyahwarna dalam air selama 5 hingga 15 minit, dokumentasikan, kemudian singkirkan baki pewarna sebelum hibridisasi.

Nilon bercas positif paling banyak digunakan dalam kerja Northern. Nitroselulosa juga sesuai dengan aliran kerja asid asetik dan asetat yang sama. Imej digunakan untuk mengesahkan pemindahan, membandingkan jalur 28S dan 18S (atau 23S dan 16S untuk RNA bakteria), menandakan penanda tangga dan piawai, serta menyimpan rekod kasar penormalan jumlah RNA. Kaedah Northern yang diterbitkan mengkuantifikasikan jalur ribosom yang diwarnai untuk semakan pemuatan, termasuk kajian sains tenusu yang menggunakan jalur ribosom yang diwarnai dengan metilena biru untuk penormalan. Membran Southern boleh dilihat dengan cara yang sama, tetapi penggunaan pewarna ini jauh lebih mantap sebagai semakan pemuatan dan pemindahan Northern. DNA Southern pula dinyahasli sebelum pemindahan, jadi angka kepekaan gel tidak boleh digunakan terus.

Had pengesanan dan latar belakang: kelemahan pewarna biru

Perbandingan di bawah sengaja diberikan sebagai anggaran. Prestasi pewarna bergantung pada peratusan gel, lebar jalur, optik dan ketelitian penyahwarnaan. Anggap setiap nombor sebagai tertib magnitud, bukan spesifikasi.

Kawalan latar belakang menentukan sama ada isyarat yang sederhana itu boleh digunakan. Pewarna bebas berwarna sangat pekat, maka kontras diperoleh dengan menyingkirkan pewarna yang tidak terikat tanpa menanggalkan pewarna yang terikat. Pewarna yang lebih pekat jarang meningkatkan kepekaan. Ia terutamanya menambah masa penyahwarnaan. Jalankan siri pencairan menggunakan gel, membran dan kamera yang sama seperti dalam kerja sebenar, dan gunakan hanya julat yang ketumpatan bersepadunya kekal berkadar dengan input. Metilena biru sesuai untuk penormalan pemuatan separa kuantitatif. Ia bukan asai kuantitatif dengan julat dinamik tinggi kerana kapasiti membran, kecekapan pemindahan, ketepuan dan penyahwarnaan berbeza antara lorong.

Had keserasian: proses yang masih boleh dilakukan selepas pewarnaan

Pengklonan selepas pewarnaan biru telah ditunjukkan. Flores dan rakan-rakan memotong jalur agarosa yang diwarnai, memulihkan DNA, kemudian melakukan ligasi dan transformasi, serta melaporkan pengklonan yang lebih baik berbanding selepas penggunaan etidium bromida dengan UV. Sebab yang mungkin ialah kerosakan cahaya yang lebih rendah, bukan manfaat daripada pewarna itu sendiri. Pendekkan pendedahan kepada cahaya putih dan murnikan DNA yang dipulihkan menggunakan prosedur pengekstrakan gel biasa.

Bukti untuk PCR dan penjujukan lebih terhad. Baki pewarna mengikat asid nukleik, jadi lakukan penyahwarnaan dan pemurnian sebelum langkah enzimatik. DNA daripada gel biru yang dimurnikan dengan betul dijangka sesuai digunakan, tetapi toleransi terhadap baki pewarna yang terbawa terus belum dikuantifikasikan dengan baik merentas pelbagai polimerase dan kimia penjujukan. Jangan anggap ia boleh diterima.

Hibridisasi blot serasi apabila urutannya dipatuhi dengan ketat: pindahkan, imobilisasikan, warnai, dokumentasikan, nyahwarna, kemudian hibridisasikan. Urutan itu ialah reka bentuk Herrin dan Schmidt. Pewarnaan sebelum pemindahan, atau meninggalkan penyahwarnaan, merupakan kaedah yang berbeza dan memerlukan pengesahannya sendiri. Selepas pewarna disingkirkan, penyingkiran prob dan pengesanan semula dengan prob secara standard boleh diteruskan seperti biasa. Untuk pewarnaan pada peringkat sel menggunakan keluarga pewarna yang sama dan sebab kaedah sediaan sapuan terfiksasi tidak boleh diterapkan terus pada kaedah sel hidup, lihat atlas pewarnaan mikroskopi.

Pemotongan jalur sesuai untuk agarosa preparatif dan oligonukleotida PAGE yang dikenal pasti kedudukannya dengan pewarna biru, dengan syarat varian fiksasi kekal dielakkan. Elektroelusi selepas penyahwarnaan munasabah dari segi kimia bagi bahan pengikat yang boleh balik, tetapi data hasil terkawal yang khusus untuk metilena biru masih terhad. Singkirkan garam atau lakukan pemendakan selepas elusi.

Kegagalan yang berulang

Jalur gel yang samar biasanya menandakan jisim yang terlalu sedikit untuk pewarnaan kolorimetri, khususnya bagi sasaran bebenang tunggal yang pendek atau RNA. Muatkan lebih banyak bahan, gunakan pewarna segar, panjangkan tempoh pewarnaan sebelum meningkatkan kepekatan, dan hentikan penyahwarnaan lebih awal. Gel biru pekat tanpa kontras biasanya menandakan pewarnaan berlebihan atau terlalu sedikit pertukaran air. Jalur PAGE yang pudar ialah hasil kimia yang dijangka, bukan kegagalan pewarnaan. Ambil foto dengan cepat. Latar belakang membran yang tidak sekata menunjukkan kemungkinan lipatan, gelembung, cap jari, penggoncangan tidak sekata atau pemindahan bertompok. Jangan tafsirkannya sebagai pemuatan tidak sama tanpa kawalan hibridisasi. Corak ribosom yang lemah dan berlumur boleh menandakan degradasi, tetapi juga pemindahan tidak lengkap, jumlah RNA terlalu sedikit (lorong lazimnya mengandungi beberapa hingga puluhan mikrogram), atau penyahwarnaan berlebihan. Pewarna menunjukkan RNA ribosom yang banyak. Ia tidak menunjukkan transkrip tertentu. Tugas itu dilakukan oleh prob.

Keselamatan dan pengendalian tanpa dakwaan berlebihan

Metilena biru lebih mudah dikendalikan berbanding etidium bromida, tetapi ia bukan tidak berbahaya. Helaian data keselamatan MilliporeSigma semasa mengelaskan pewarna ini dalam Kategori 4 ketoksikan akut melalui mulut, berbahaya jika tertelan, dan menghendaki pelupusan melalui saluran sisa yang diluluskan seperti dalam SDS metilena biru Sigma-Aldrich. Etidium bromida mempunyai amaran genotoksisiti yang lebih kuat, termasuk kesan terhadap sel germa yang disyaki dalam SDS etidium bromida Sigma-Aldrich, dan gel serta larutannya lazimnya diasingkan sebagai sisa kimia berbahaya seperti yang dinyatakan dalam panduan pewarna asid nukleik Thermo Fisher. Patuhi SDS dan peraturan institusi untuk kedua-duanya. Simpan pewarna kering dalam bekas yang tertutup rapat dan dalam keadaan kering, gunakan semula larutan pewarna kerja hanya sebagaimana yang dibenarkan oleh protokol, simpan membran yang diwarnai dalam keadaan kering di antara helaian penapis, dan ambil foto gel sebelum jalur menghilang akibat resapan.

Ingat rumusan ringkas untuk kerja makmal ini. Gel menguji kebolehlihatan pada pemuatan tinggi di bawah cahaya putih. Membran menguji pemindahan dan pemuatan sebelum prob melakukan kerja pengesanan yang peka. Satu pewarna memenuhi kedua-dua tujuan, dengan kepekaan sederhana, pengikatan boleh balik dan urutan operasi yang ketat.