Metilena biru dan pengisyaratan keradangan: inflammasom, IL-6, dan STAT3

Bayangkan tiga makmal melaporkan bahawa sebatian biru yang sama bersifat antiradang. Satu menunjukkan pengurangan IL-1beta daripada makrofaj. Satu menunjukkan pengurangan enzim iNOS dalam jenis sel yang sama. Satu lagi menunjukkan pengurangan IL-6 dalam darah dan aktiviti STAT3 dalam otak. Memang mudah untuk menggabungkan ketiga-tiganya menjadi satu dakwaan. Namun, penggabungan itu mengaburkan dapatan sebenar.

Setiap hasil tergolong dalam konsep pengisyaratan yang berbeza, dengan pencetus, langkah pembentukan, dan ukuran hasilnya sendiri. Metilena biru berinteraksi dengan setiap konsep pada titik yang berbeza. Sama ada semua ini memperbaik hasil kesihatan ialah persoalan berasingan yang dibincangkan dalam gambaran keseluruhan metilena biru dan keradangan kami. Halaman ini menumpukan pada laluan pengisyaratan.

Laluan 1: pembentukan inflammasom dan kaspase-1

Inflammasom ialah rangka protein yang dibina apabila diperlukan di dalam sel mieloid. Komponennya ialah penderia, penyesuai yang dipanggil ASC, dan enzim efektor yang dipanggil kaspase-1. Setelah rangka ini terbentuk, kaspase-1 memotong pro-IL-1beta dan pro-IL-18 menjadi bentuk yang dirembeskan, dan boleh mencetuskan piroptosis, iaitu bentuk kematian sel yang bersifat keradangan. Penderia menentukan jenisnya: NLRP3 bertindak balas terhadap kristal dan toksin pembentuk liang seperti nigerisin dan ATP, NLRC4 bertindak balas terhadap flagelin bakteria, AIM2 bertindak balas terhadap DNA dwirantai dalam sitosol, manakala laluan bukan kanonik bertindak balas terhadap lipopolisakarida intrasel.

Pengaktifan memerlukan dua isyarat. Isyarat pertama ialah pemprimaan: ligan reseptor seakan Toll memacu transkripsi NLRP3 dan pro-IL-1beta yang bergantung pada NF-kB supaya komponen yang diperlukan tersedia. Isyarat kedua ialah pembentukan kompleks: pencetus kedua menyebabkan ASC beroligomer menjadi bintik, kaspase-1 dipotong menjadi fragmen p20, dan IL-1beta p17 matang dilepaskan. Spesies oksigen reaktif mitokondria dan pengambilan kristal diketahui menyumbang kepada isyarat kedua bagi NLRP3.

Kajian makrofaj pada 2017 tentang perencatan pelbagai jenis inflammasom menguji metilena biru pada kedua-dua isyarat. Dalam makrofaj sumsum tulang tikus yang telah diprima dengan lipopolisakarida, nigerisin, ATP, dan kristal monosodium urat masing-masing mencetuskan pelepasan IL-1beta dan kaspase-1 serta pembentukan bintik ASC. Metilena biru pada 20 hingga 200 micromolar mengurangkan ketiga-tiganya mengikut dos tanpa membunuh sel. Flagelin dan Salmonella untuk NLRC4, DNA dwirantai dan Listeria untuk AIM2, serta lipopolisakarida yang dimasukkan melalui transfeksi atau E. coli hidup untuk laluan bukan kanonik menunjukkan corak yang sama. Sebatian itu sahaja tidak mencetuskan pelepasan, dan plat kawalan tidak menunjukkan kesan antibakteria, maka hasil ini berkaitan dengan tindak balas perumah.

Pada peringkat hulu, tiga intervensi diukur. Superoksida mitokondria yang dicetuskan oleh rotenon berkurang dengan metilena biru, begitu juga pelepasan IL-1beta yang dipacu oleh rotenon. Pengambilan manik berpendar turut berkurang, selaras dengan pengurangan fagositosis sebelum pengesanan kristal. Sistem pelapor yang dipacu oleh promoter NLRP3 dengan dua tapak NF-kB menunjukkan aktiviti yang lebih rendah dengan metilena biru, manakala promoter yang dipendekkan tanpa tapak tersebut tidak menunjukkan tindak balas. Dalam tabung tanpa sel, metilena biru juga secara langsung mengurangkan aktiviti kaspase-1 manusia rekombinan. Penambahan sebatian itu hanya semasa pemprimaan atau hanya semasa pengaktifan tetap mengurangkan pelepasan IL-1beta, IL-18, dan kaspase-1, maka kedua-dua langkah terlibat.

Ujian pada tikus menunjukkan corak selektiviti yang sama. Dos lipopolisakarida yang membawa maut membunuh tikus kawalan dalam beberapa jam, manakala metilena biru meningkatkan kelangsungan hidup; IL-1beta peritoneum berkurang tetapi IL-6 dalam cecair yang sama tidak berkurang. Dalam model peritonitis Listeria, IL-1beta peritoneum berkurang manakala jumlah keseluruhan sel tidak berubah. Monosit THP-1 manusia menunjukkan tindak balas seperti makrofaj tikus bagi keempat-empat jenis inflammasom. Hasil berkaitan inflammasom menerangkan pematangan IL-1beta dan IL-18, bukan setiap sitokin. Oleh itu, bentuk sel imun otak dalam eksperimen mikroglia dan astrosit menjawab persoalan yang berbeza daripada pembentukan rangka protein.

Laluan 2: transkripsi iNOS melalui pengikatan NF-kB dan STAT1

Sintase nitrik oksida teraruh, atau iNOS, hampir tidak hadir dalam keadaan rehat dan ditranskripsi apabila diperlukan. Lipopolisakarida memacunya terutamanya melalui penguraian IkB-alpha, diikuti oleh pemfosforilan NF-kB dan kemasukannya ke dalam nukleus. Interferon-gamma memacunya terutamanya melalui pemfosforilan STAT1 oleh kinase Janus, diikuti oleh kemasukan STAT1 ke dalam nukleus. Setiap faktor kemudian mengikat tapaknya pada promoter iNOS. Aktiviti enzim dan induksi gen ialah titik kawalan yang berasingan, dan sesuatu ubat boleh bertindak pada salah satu atau kedua-duanya.

Kajian pada 2015 tentang induksi iNOS dalam makrofaj dan tikus yang mengalami endotoksemia mengenal pasti kesan tersebut pada peringkat RNA pengutus. Dalam sel RAW 264.7 dan makrofaj primer tikus, 1 micromolar metilena biru yang diberikan 30 minit sebelum lipopolisakarida, interferon-gamma, atau kedua-duanya mengurangkan protein dan mRNA iNOS sepanjang 8 hingga 24 jam, dengan nitrit yang lebih rendah dalam medium dan tanpa kehilangan daya hidup sel. Dalam tikus yang diberi 25 mg per kg lipopolisakarida, satu dos 5 mg per kg yang diberikan satu jam lebih awal mengurangkan protein dan mRNA iNOS dalam paru-paru, hati, dan jantung.

Butiran yang membezakan dapatan ini ialah perkara yang tidak berubah. Penguraian IkB-alpha, pemfosforilan NF-kB, pemfosforilan STAT1, dan pengumpulan kedua-dua faktor dalam nukleus kekal tidak terjejas. Gangguan berlaku satu langkah kemudian: ekstrak nukleus menunjukkan pengurangan pengikatan NF-kB pada unsur DNAnya selepas lipopolisakarida dan pengurangan pengikatan STAT1 selepas interferon-gamma. Imunopresipitasi kromatin mengesahkan pengurangan pengikatan kedua-dua faktor pada promoter iNOS di dalam sel. Faktor nekrosis tumor alfa, yang promoternya juga menggunakan NF-kB, turut berkurang. Faktor-faktor tersebut diaktifkan dan sampai ke nukleus, tetapi pengikatannya pada DNA sasaran adalah lemah.

Perhatikan perbezaannya dengan laluan 1. Ini berkaitan dengan pengikatan faktor pada DNA, menggunakan STAT1 dan bukannya STAT3, serta mengukur mRNA, protein, dan nitrit, bukannya bintik ASC dan fragmen kaspase-1. Peta sasaran metilena biru merentas model sel kami memisahkan peringkat transkripsi ini daripada pengukuran langsung enzim dan mitokondria.

Laluan 3: IL-6 serum dan pengaktifan STAT3 dalam tisu

IL-6 menghantar isyarat melalui keluarga reseptor gp130 kepada lata kinase Janus ke STAT3. STAT3 yang terfosforil membentuk dimer, memasuki nukleus, dan memacu program keradangan, manakala IL-6 sendiri ialah sasaran NF-kB. Oleh itu, kedua-duanya membentuk gelung maklum balas yang sering dipanggil paksi IL-6 kepada STAT3. Ukuran hasil standard ialah IL-6 serum di peringkat hulu, nisbah STAT3 terfosforil kepada jumlah STAT3, dan enzim efektor seperti iNOS dan COX2 di peringkat hilir.

Kajian tikus pada 2023 tentang IL-6 dan STAT3 selepas lipopolisakarida mengukur paksi ini merentas kompartmen. Tikus jantan C57BL/6 menerima 1 mg per kg lipopolisakarida setiap hari selama tiga hari, dengan 5 atau 10 mg per kg metilena biru 30 minit selepas setiap dos. Pada hari ketiga, IL-6 serum lebih rendah dalam kedua-dua kumpulan metilena biru berbanding kumpulan yang menerima lipopolisakarida sahaja, manakala kebanyakan sitokin lain dalam panel tidak berubah dengan rawatan. Nisbah STAT3 terfosforil kepada jumlah STAT3 lebih rendah dalam korteks, hipokampus, dan kulit telinga, dengan pewarnaan mikroglia Iba-1 yang lebih rendah, iNOS dan COX2 yang lebih rendah, serta pengurangan sebahagian kehilangan berat badan.

Dua perkara perlu diberi perhatian di sini. IL-6 serum yang lebih rendah bersama pemfosforilan STAT3 tisu yang lebih rendah selaras dengan modulasi paksi, tetapi tidak mengenal pasti titik utama yang terjejas. Ini kerana pengurangan sitokin di peringkat hulu, pengurangan pengisyaratan reseptor, atau perubahan aktiviti fosfatase masing-masing boleh menghasilkan nisbah yang sama. Selain itu, berat badan sepanjang tiga hari pendedahan akut ialah ukuran pada peringkat keseluruhan haiwan, bukan skor gejala atau remisi. Ia menambah konteks melangkaui hasil blot tanpa menukar hasil pengisyaratan menjadi dakwaan rawatan. Proses kimia pengendalian redoks mitokondria yang berasingan berlaku selari dengan proses sitokin ini dan tidak patut digabungkan dengannya.

Perbandingan laluan: titik intervensi dan ukuran hasil

Jadual ini menghalang tiga pemindahan kesimpulan yang tidak sah. Hasil berkaitan bintik ASC tidak membuktikan hasil berkaitan STAT3. Hasil pengikatan STAT1 pada promoter iNOS tidak membuktikan hasil berkaitan STAT3, walaupun kedua-dua protein ialah anggota keluarga STAT. Hasil IL-6 serum tidak membuktikan pengurangan pembentukan inflammasom: dalam eksperimen peritoneum, IL-1beta berkurang manakala IL-6 tidak berkurang. Setiap baris memerlukan pencetus dan ukuran hasilnya sendiri. Oleh itu, apabila membaca kajian metilena biru pada sel, haiwan, dan manusia, setiap dakwaan mesti dipadankan dengan peringkat yang diukur.

Semua ini tidak menetapkan dos, keselamatan, atau manfaat pada manusia. Model lipopolisakarida ialah pencetus terkawal untuk menguji mekanisme, bukan replika penyakit kronik. Pemberian dos seiring dengan pencetus menguji pencegahan perubahan yang diaruh, bukannya pembalikan penyakit yang sudah terbentuk. Asingkan penerangan mekanisme ini daripada hasil pada pesakit, dan nilai setiap dakwaan kesihatan berdasarkan kajian pesakit yang menyokongnya.