Metilena biru dan ALS: mengapa hasil berbeza antara model eksperimen

Cari metilena biru dan ALS, dan anda akan menemui dua dakwaan yang kelihatan bercanggah. Satu menyatakan bahawa pewarna biru itu melindungi neuron dalam model ALS. Satu lagi menyatakan bahawa ia tidak memberi sebarang kesan pada mencit model ALS. Kedua-dua dakwaan memetik makalah sebenar, dan kedua-dua makalah wajar diberi perhatian serius. Percanggahan itu terlerai apabila anda menyatakan konsep di sebalik setiap eksperimen: model menentukan skop dakwaan.

Hasil pada cacing ialah dakwaan tentang cacing. Hasil pada larva ikan ialah dakwaan tentang larva ikan. Kedua-duanya bukan dakwaan tentang pesakit sehingga disokong oleh bukti sepanjang perjalanan penyakit pada mamalia. Artikel ini membandingkan dua makalah yang paling kerap dipetik secara bersebelahan supaya anda dapat melihat mengapa jawapannya berbeza.

Dua eksperimen dalam satu jadual

Biarkan jadual ini terbuka semasa anda membaca. Setiap perbezaan penting antara kajian dimuatkan di dalamnya.

Genetik berbeza, spesies berbeza, laluan pemberian dos berbeza, masa berbeza, dan titik akhir berbeza. Genotip hanyalah satu daripada lima perbezaan, jadi pasangan kajian ini tidak dapat membuktikan bahawa metilena biru bertindak secara selektif pada satu laluan ALS. Ia membuktikan sesuatu yang lebih terhad tetapi masih berguna: pemulihan yang ketara melalui pendedahan langsung awal dalam model ringkas tidak diterjemahkan kepada perjalanan penyakit mamalia dengan pemberian oral kronik.

Hasil positif: perkara yang ditunjukkan oleh kajian cacing dan ikan

Kajian cacing dan ikan 2012 mengekspresikan TDP-43 atau FUS manusia mutan dalam neuron motor cacing dan menyuntik mRNA manusia mutan ke dalam embrio ikan. Ini ialah model proteotoksisiti. Model ini menghasilkan semula kesan toksik protein mutan terhadap pergerakan dan bentuk neuron dalam tempoh beberapa hari, bukan keseluruhan perjalanan ALS pada manusia dewasa selama bertahun-tahun.

Rawatan bermula sangat awal. Cacing membesar pada agar yang mengandungi metilena biru sejak menetas. Embrio ikan direndam dalam larutan ubat semalaman bermula 24 jam selepas persenyawaan, dengan tingkah laku diuji kira-kira dua hari kemudian. Tiada sawar darah-otak yang memisahkan ubat daripada neuron seperti pada mamalia, dan paras ubat dalam plasma atau otak tidak diukur.

Dalam keadaan tersebut, kesannya besar dan konsisten. Kedua-dua kepekatan 6 dan 60 μM mengurangkan kelumpuhan bergantung pada usia dalam cacing TDP-43 dan FUS. Pada hari ke-12 peringkat dewasa, kira-kira 80 peratus cacing TDP-43 yang tidak dirawat mengalami kelumpuhan berbanding kira-kira 10 peratus cacing yang dirawat sejak menetas. Asai sinaptik menunjukkan arah yang sama: cacing TDP-43 sangat sensitif terhadap aldikarb, ubat yang digunakan untuk menilai penghantaran neuromuskular, dan metilena biru mengubah respons itu kembali menghampiri normal. Bilangan unjuran neuron motor yang mengalami degenerasi menurun, dengan kesan paling jelas pada 60 μM. Pada ikan, renangan yang dicetuskan oleh sentuhan bertambah baik dengan ketara dan akson motor yang memendek tumbuh semula menghampiri panjang normal pada 30 atau 60 μM, walaupun pemulihannya separa dan bukan sepenuhnya.

Data tekanan oksidatif selaras dengan tafsiran antioksidan. Cacing dan ikan mutan menunjukkan bacaan spesies oksigen reaktif yang meningkat dan menurun dengan rawatan, manakala cacing normal yang menerima metilena biru bertahan jauh lebih lama selepas cabaran prooksidan berbanding cacing yang tidak dirawat. Namun, dua batasan penting perlu diambil kira. Jumlah paras protein TDP-43 dan FUS mutan tidak menurun, dan kajian itu tidak mengukur agregat protein secara langsung. Oleh itu, ia menunjukkan pemulihan fungsi tanpa membuktikan penyingkiran agregat. Sesiapa yang mengikuti cara hipotesis redoks dan mitokondria biasanya dirangka harus menganggap mekanisme itu disokong oleh bukti tetapi belum dipastikan.

Masa rawatan ialah perincian yang paling memberikan pengajaran. Apabila penulis menunggu hingga hari ke-5 peringkat dewasa untuk memulakan rawatan, kadar kelumpuhan pada hari ke-12 ialah kira-kira 55 peratus berbanding kira-kira 10 peratus dengan rawatan sejak menetas. Ubat yang sama, cacing yang sama, mutasi yang sama, tetapi kesan jauh lebih kecil. Pendedahan profilaktik awal menyumbang sebahagian besar manfaat yang kelihatan.

Hasil nol: perkara yang ditunjukkan oleh kajian mencit SOD1

Kajian mencit 2011 mengemukakan soalan yang lebih sukar dalam sistem yang lebih ketat. Mencit kongenik SOD1 G93A berkembang daripada tremor anggota belakang kepada gangguan gaya berjalan dan kehilangan refleks membetulkan kedudukan badan, hingga mencapai titik akhir terminal yang ditetapkan terlebih dahulu. Rawatan bermula sebelum gejala muncul pada hari ke-45 dan diteruskan setiap hari, dengan pemerhati memberikan skor neurologi pada skala 0 hingga 6. Ini ialah eksperimen yang meliputi keseluruhan perjalanan penyakit, menjadikannya lebih dekat dengan perkara yang penting kepada pesakit berbanding mana-mana lengkung kelumpuhan pada cacing.

Hasil utama adalah nol. Permulaan gejala secara keseluruhan berlaku pada 121 hari dalam kumpulan kawalan berbanding 124 hari dengan metilena biru, perbezaan yang tidak signifikan. Kelangsungan hidup hingga peringkat akhir ialah 167 hari berbanding 170 hari, juga tidak signifikan. Beberapa analisis sekunder memihak kepada rawatan: mencit betina menunjukkan kelewatan permulaan gejala kira-kira 7 hari, dan haiwan yang dirawat menghabiskan sedikit lebih banyak masa dalam peringkat yang lebih ringan serta kurang masa dalam peringkat yang teruk. Dengan subkumpulan jantina yang kecil dan banyak perbandingan peringkat, hasil tersebut lebih sesuai dianggap sebagai asas pembentukan hipotesis dan bukannya bukti. Tiada pengiraan neuron, asai pengagregatan SOD1, atau penanda oksidatif atau keradangan diukur. Oleh itu, kajian itu juga tidak dapat menentukan sama ada ubat mencapai sasarannya tetapi gagal bertindak, atau langsung tidak bertindak pada sasaran pada dos ini. Hanya satu dos diuji.

Penulis sendiri mengetengahkan batasan paling mendasar, yang terpakai dalam kedua-dua arah. SOD1 G93A dengan bilangan salinan tinggi memodelkan penyakit akibat ketoksikan SOD1 dengan baik, tetapi penyakit SOD1 merangkumi sebahagian kecil ALS familial dan mempunyai biologi yang berbeza daripada kebanyakan penyakit sporadik. Mereka mencadangkan supaya calon rawatan diuji semula dalam model mamalia berasaskan TDP-43. Cadangan itu kemudiannya menjadi lebih rumit kerana penulis kajian cacing dan ikan menyatakan bahawa satu kajian berasingan tentang metilena biru pada mencit TDP-43 juga gagal memperbaiki hasil motor. Oleh itu, sesuatu sebatian boleh menunjukkan kesan yang kuat dalam satu sistem TDP-43 tetapi tiada kesan dalam sistem TDP-43 yang lain. Sistem sama pentingnya dengan gen.

Mengapa penambahbaikan pada cacing atau ikan tidak dapat membuktikan manfaat pada pesakit

Anggap setiap model sebagai menjawab soalan yang berbeza.

Pertama, biologinya berbeza. TDP-43 dan FUS ialah protein pengikat asid nukleik dengan interaksi genetik yang dikongsi dalam sistem ringkas ini, manakala ketoksikan SOD1 berlaku melalui mekanisme proksimal yang sebahagiannya berbeza. Ubat yang mengurangkan satu tekanan proteotoksik tidak semestinya mengurangkan yang lain, dan kejayaan terhadap ekspresi berlebihan pada embrio tidak semestinya meramalkan kejayaan terhadap neurodegenerasi perlahan pada dewasa yang melibatkan keradangan, penglibatan glia dan kemerosotan sistemik.

Kedua, pendedahannya berbeza. Pendedahan rendaman berterusan pada kepekatan mikromolar bukanlah pemberian dos oral. Penyerapan usus, metabolisme laluan pertama, pengikatan protein plasma, penembusan ke otak dan penyingkiran ubat semuanya menjadi pengantara antara dos yang ditelan dengan neuron motor spina. Kedua-dua kajian tidak mengukur paras ubat dalam sistem saraf, jadi kedua-duanya tidak dapat mengaitkan kepekatan masing-masing antara satu sama lain.

Ketiga, masanya berbeza. Manfaat pada cacing dan ikan sangat bergantung pada rawatan sebelum patologi terkumpul. Rawatan mencit juga bermula sebelum gejala muncul, yang merupakan satu kekuatan kajian. Namun, rawatan manusia hampir sentiasa bermula selepas gejala muncul, iaitu lebih lewat lagi. Isyarat profilaktik dalam asai embrio dua hari ialah titik permulaan penyelidikan, bukan model penggunaan klinikal.

Keempat, titik akhirnya berbeza. Kelumpuhan pada 12 hari, kepekaan terhadap aldikarb, panjang akson dalam mikrometer dan jarak renangan ialah fenotip proksimal. Permulaan gejala dan kelangsungan hidup pada mamalia menggabungkan setiap proses pampasan dan proses yang merumitkan keadaan dalam tubuh. Ubat sering mengubah bacaan proksimal tanpa mengubah kelangsungan hidup. Itulah sebabnya titik akhir masa hingga kejadian pada mamalia digunakan.

Pembaca yang mahukan senarai semak untuk tajuk utama seterusnya boleh menggunakan panduan daripada cara membaca kajian praklinikal: tanyakan spesies, transgen, dos dan laluan pemberian, sama ada paras ubat diukur, bila rawatan bermula berbanding perkembangan patologi, sama ada titik akhir ialah fenotip jangka pendek atau perjalanan penyakit, dan sama ada kesannya dihasilkan semula di makmal kedua. Asas bukti manusia yang lebih luas bagi metilena biru tetap menjadi tempat untuk menyemak sama ada mana-mana isyarat awal ini berkembang menjadi data klinikal.

Maknanya bagi pesakit dan keluarga

Makalah ini tidak menghasilkan sebarang protokol metilena biru yang mantap untuk ALS. Kajian positif menyokong penyelidikan lanjut tentang mekanisme oksidatif dan sinaptik dalam biologi TDP-43 dan FUS. Kajian dengan hasil nol pula tidak menyokong jangkaan pengubahsuaian penyakit melalui pemberian oral kronik pada tahap pendedahan ini dalam penyakit jenis SOD1. Secara bersama, kedua-duanya menggambarkan ketidakselarasan antara model, bukan saranan rawatan.

Keselamatan perlu dibincangkan dengan sikap berhati-hati yang sama seperti keberkesanan. Kajian ALS pada mencit tidak memberikan maklumat tentang dos yang selamat untuk manusia, dan metilena biru membawa risiko sebenar melalui hemolisis dalam kekurangan G6PD serta ketoksikan serotonin apabila digabungkan dengan ubat serotonergik. Kekurangan G6PD yang disyaki, penggunaan antidepresan semasa dan sebarang perubahan ubat yang dirancang perlu dibincangkan dengan doktor, begitu juga semakan data keselamatan umum metilena biru sebelum sesiapa bertindak berdasarkan tajuk utama tentang hasil makmal.

Kesimpulannya dapat dirangkum dalam satu ayat. Metilena biru menghasilkan pemulihan yang ketara melalui pendedahan awal pada fenotip cacing dan larva ikan TDP-43 dan FUS, tetapi hampir tiada manfaat terhadap permulaan gejala atau kelangsungan hidup dalam kajian mencit SOD1 dengan pemberian oral kronik. Oleh itu, tafsiran yang jujur ialah bukti bergantung pada model dan tidak menyokong penggunaan pada pesakit.