Membaca rupa koloni E. coli dan koloni lain pada agar EMB

Seorang pelajar menggoreskan sampel yang belum dikenal pasti pada agar eosin metilena biru, mengeramkannya semalaman, lalu kembali menemui piring yang mengandungi koloni gelap dengan kilauan hijau. Catatan dalam buku nota berbunyi "E. coli, disahkan." Catatan itu membuat kesimpulan yang melampaui bukti daripada piring tersebut. Piring itu menunjukkan fenotip pertumbuhan dan penapaian dalam keadaan tertentu. Identiti spesies ialah dakwaan berasingan yang memerlukan bukti berasingan.

Panduan ini melihat hasil agar EMB sebagai tugas pentafsiran. Panduan ini menerangkan konsep asasnya, membincangkan atlas ilustrasi piring berserta kawalan, dan mengenal pasti keadaan apabila gambaran dalam buku teks boleh mengelirukan.

Konsep di sebalik piring

Agar EMB bersifat selektif dan pembezaan. Pewarna eosin Y dan metilena biru menekan pertumbuhan banyak organisma Gram positif, maka medium ini lebih menyokong pertumbuhan organisma Gram negatif. Pewarna yang sama juga bertindak sebagai penunjuk: apabila organisma menapai gula yang tersedia dan menghasilkan asid setempat yang mencukupi, koloni menyerap banyak pewarna lalu bertukar menjadi ungu gelap hingga biru kehitaman. Dengan penghasilan asid yang kuat, permukaan koloni boleh memperlihatkan kilauan metalik hijau beririsasi. Protokol ASM untuk piring agar eosin metilena biru menerangkan gabungan sifat selektif dan pembezaan ini serta menyediakan foto rujukan untuk pengajaran.

Satu butiran penting sebelum membaca sebarang hasil: semak formulasi yang digunakan. Formulasi Holt Harris Teague yang lebih lama mengandungi laktosa serta sukrosa, manakala EMB Levine mengandungi laktosa sahaja. Organisma yang menapai sukrosa tetapi bukan laktosa, seperti banyak isolat Serratia marcescens, boleh kelihatan berbeza pada kedua-dua versi ini. Dokumentasi pengilang untuk medium EMB menyatakan perbezaan formulasi ini dengan jelas. Catat pengilang dan formulasi dalam buku nota bersama-sama hasilnya.

Agar EMB yang telah disediakan tetapi belum diinokulasi biasanya berwarna merah kecoklatan hingga ungu kemerahan, kadangkala dengan rona kehijauan atau mendakan halus. Warna latar itu bukan pertumbuhan. Bandingkan setiap bacaan dengan piring yang belum diinokulasi atau keadaan asas yang didokumenkan, dan baca piring primer selepas kira-kira 18 hingga 24 jam pengeraman aerob pada 35 hingga 37 C melainkan protokol pengajaran menetapkan sebaliknya. Pengeraman yang berpanjangan boleh mengubah rupa penapaian.

Cara memeriksa piring

Gunakan dua jenis pencahayaan. Mula-mula, periksa piring di bawah cahaya pantulan atau cahaya serong sambil mencondongkannya: kilauan metalik bersifat beririsasi dan boleh muncul atau hilang mengikut sudut pandangan. Kemudian periksa dengan cahaya yang menembusi piring untuk menilai warna koloni dan pusat yang gelap. Gunakan koloni yang terasing dengan baik kerana pertumbuhan padat dan koloni bersebelahan mengubah pengumpulan asid setempat serta boleh mengurangkan atau menguatkan warna. Koleksi imej ASM menunjukkan perkara ini secara langsung: E. coli dalam kultur campuran mungkin kehilangan kilauan yang dijangka kerana organisma di sekelilingnya mengubah persekitaran asid.

Sertakan kawalan apabila latihan membenarkannya. Set pengajaran yang lazim ialah E. coli ATCC 25922 untuk fenotip biru kehitaman dan kilauan metalik, organisma bukan penapai seperti Salmonella Typhimurium ATCC 14028 atau Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 untuk fenotip tidak berwarna, dan organisma Gram positif seperti Enterococcus faecalis atau Staphylococcus aureus sebagai kawalan perencatan, seperti yang disenaraikan dalam jadual QC standard untuk medium EMB. Jika kawalan positif tidak menunjukkan kilauan, syaki keadaan pengeraman, pertumbuhan padat, atau formulasi terlebih dahulu sebelum mengesyaki sampel yang belum dikenal pasti.

Atlas ilustrasi piring

Piring di bawah ialah ilustrasi yang dijana, bukan foto kultur sebenar. Ilustrasi ini menunjukkan corak yang perlu dicari, bukan rona tepat bagi mana-mana strain tertentu. Bandingkan dengan foto rujukan ASM dan dengan piring sebenar dari makmal pengajaran.

Piring 1: Escherichia coli pada agar EMB, penapai laktosa yang kuat

E. coli pada agar EMB biasanya berwarna ungu gelap hingga biru kehitaman, sering kali dengan pusat gelap dan kilauan metalik hijau akibat penghasilan asid yang kuat. Kilauan itu ialah ciri terkenal yang dicari oleh pelajar, tetapi anggaplah ia sebagai bukti sokongan, bukan ciri penentu. Keamatan kilauan berbeza mengikut strain, tempoh pengeraman, kepadatan koloni, dan sudut pandangan. Ketiadaan kilauan tidak menolak kemungkinan E. coli, manakala koloni gelap tanpa kilauan boleh menunjukkan beberapa organisma penapai lain. Pilih koloni yang terasing dengan baik untuk sebarang kerja susulan, bukannya membuat bacaan daripada sektor yang padat.

Piring 2: Klebsiella pneumoniae pada agar EMB, penapai mukoid

Klebsiella pneumoniae pada agar EMB biasanya membentuk koloni besar, berkilat, dan mukoid dengan rona merah jambu keunguan hingga coklat keunguan, sering kali dengan pusat gelap tetapi biasanya tanpa kilauan metalik yang kuat. Morfologi serupa terdapat pada penapai yang berkaitan seperti Enterobacter. Tekstur mukoid dan saiz koloni merupakan sebahagian daripada bacaan: koloni merah jambu yang kecil dan rata membawa makna yang berbeza berbanding koloni mukoid besar berbentuk kubah. Seperti E. coli, piring itu mencadangkan fenotip penapaian, dan penamaan pada peringkat spesies memerlukan pengesahan biokimia yang diterangkan di bawah.

Piring 3: Salmonella pada agar EMB dan organisma bukan penapai lain, koloni tidak berwarna

Salmonella pada agar EMB dan organisma berkaitan yang tidak menapai laktosa, termasuk Shigella dan banyak isolat Pseudomonas, biasanya tumbuh sebagai koloni tidak berwarna hingga lut cahaya atau berwarna ambar pucat. Sesetengah formulasi dan keadaan menghasilkan rona merah jambu yang samar, maka koloni merah jambu pucat tidak semestinya organisma penapai. EMB tidak membezakan Salmonella daripada Shigella atau daripada organisma bukan penapai lain; perbezaan itu ditentukan melalui ujian kemudian. Perhatikan juga bahawa strain Salmonella positif laktosa dengan koloni metalik menyerupai E. coli telah didokumenkan, dan ini satu lagi sebab mengapa satu piring sahaja tidak dapat memberikan kesimpulan muktamad.

Piring 4: Serratia marcescens dan perangkap formulasi

Serratia marcescens diberi bahagian tersendiri kerana pelajar sering menjangkakan koloni merah lalu tersalah membaca piring. Kebanyakan isolat klinikal tidak menapai laktosa, maka pada EMB Levine, isolat ini lazimnya kelihatan pucat hingga berwarna lemah. Oleh sebab banyak isolat menapai sukrosa, formulasi yang mengandungi sukrosa mungkin menghasilkan tindak balas yang lebih gelap atau lebih berkaitan dengan asid. Jangan juga menjangkakan pigmen prodigiosin merah yang lazim pada 35 hingga 37 C; penghasilan pigmen tidak konsisten pada suhu inkubator. Apabila protokol menyebut Serratia marcescens pada agar EMB, semak formulasi yang diandaikan oleh pernyataan tersebut. Ulasan tentang metabolisme Serratia merumuskan corak laktosa negatif dan penapaian sukrosa yang berubah-ubah di sebalik perangkap ini.

Piring 5: kawalan dan organisma yang direncat

Organisma Gram positif seperti Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus, dan Bacillus secara umumnya direncat atau pertumbuhannya ditekan dengan ketara pada agar EMB, walaupun perencatan tidak berlaku sepenuhnya bagi setiap strain. Set kawalan memastikan bacaan berlandaskan bukti: kawalan E. coli sepatutnya menunjukkan pertumbuhan yang baik dengan warna biru kehitaman dan kilauan, kawalan bukan penapai sepatutnya menunjukkan pertumbuhan tidak berwarna, dan kawalan perencatan sepatutnya menunjukkan sedikit atau tiada pertumbuhan. Jika kawalan perencatan tumbuh dengan baik, langkah pemilihan telah gagal dan semua bacaan lain daripada kelompok itu boleh dipersoalkan. Kaedah pewarnaan menjawab persoalan yang berbeza daripada medium kultur; untuk aspek pewarnaan slaid di makmal, lihat atlas pewarnaan metilena biru.

Perbandingan dengan batas tafsiran

Tiga ayat merumuskan rupa yang mengelirukan. Warna gelap tidak semestinya E. coli, kerana Klebsiella, Enterobacter, dan penapai lain membentuk pusat gelap tanpa kilauan. Warna merah jambu tidak semestinya Klebsiella, kerana penapai sederhana atau perlahan serta sesetengah organisma yang lazimnya dianggap bukan penapai kelihatan merah jambu atau ungu lavender. Kilauan tidak membuktikan E. coli secara muktamad, kerana penapai kuat lain boleh menghasilkannya. Protokol pengajaran dan rajah kultur campurannya menggambarkan setiap kelemahan tafsiran ini.

Batas pengesahan

Agar EMB menunjukkan fenotip, bukan spesies. Organisma yang berbeza boleh mempunyai rupa koloni yang sama, dan satu organisma boleh menyimpang daripada gambaran buku teksnya mengikut strain, usia, pertumbuhan padat, formulasi, dan pengeraman. Itulah sebabnya aliran kerja pengajaran dan klinikal menganggap morfologi EMB sebagai petunjuk sementara.

Aliran kerja pelajar yang boleh dipertahankan ialah: huraikan koloni terasing (saiz, warna, pusat, kilauan di bawah cahaya serong, ciri mukoid), catat formulasi, tempoh dan suhu pengeraman, serta kawalan; kemudian lakukan subkultur koloni yang terasing dengan baik untuk mendapatkan kultur tulen sebelum sebarang ujian pengesahan. Ujian susulan yang lazim termasuk pewarnaan Gram serta tindak balas IMViC untuk pengecaman presumptif E. coli dan koliform, TSI atau KIA serta panel biokimia khusus organisma untuk organisma enterik, dengan pengecaman serologi, MALDI TOF, atau kaedah lain yang telah disahkan apabila tugasan memerlukannya. Untuk latar belakang tentang kedudukan EMB dalam kalangan medium enterik selektif dan pembezaan, lihat pengenalan kepada medium kultur enterik dan ujian susulan pewarnaan Gram. Bagi persoalan berkaitan tentang perkara yang boleh dan tidak boleh dibuktikan oleh pewarnaan biru pada slaid, atlas pewarnaan metilena biru turut memisahkan pemerhatian daripada kesimpulan dengan pendekatan yang sama.

Tulis pemerhatian sebelum kesimpulan. "Koloni biru kehitaman gelap dengan kilauan hijau yang bergantung pada sudut pandangan pada EMB Levine selepas 24 jam, selaras dengan penapaian laktosa yang kuat" ialah pernyataan yang boleh dipertahankan. "E. coli, disahkan" memerlukan langkah pengesahan yang tidak dapat dipenuhi oleh piring itu sahaja.