Biru metilena dalam ujian makmal G6PD: fungsi sebenar pewarna ini

Seorang pelajar memerhatikan dua tabung selepas inkubasi. Satu tabung telah bertukar kepada warna yang dijangka. Satu lagi tidak. Pelajar itu menyimpulkan bahawa pesakit kedua mengalami kekurangan glukosa-6-fosfat dehidrogenase. Kesimpulan itu mungkin betul, tetapi penaakulannya mengabaikan konsep yang mendasari ujian ini. Tiada apa-apa dalam tabung itu yang mengukur enzim secara langsung. Tabung itu mengukur hasil yang dihasilkan oleh enzim, dengan biru metilena sebagai perantara.

Apabila kaedah pengukuran tidak langsung ini difahami, prosedur, kawalan, dan senarai panjang keputusan palsu tidak lagi kelihatan sewenang-wenangnya.

Jawapan ringkas

Biru metilena dalam ujian G6PD ialah penunjuk redoks. Enzim G6PD menghasilkan NADPH, dan sistem yang bergantung pada NADPH menurunkan biru metilena yang berwarna biru kepada bentuk leukonya yang tidak berwarna (atau menggunakannya untuk memindahkan elektron). Aktiviti enzim yang normal membolehkan penurunan yang cekap. Aktiviti yang rendah menyebabkan penurunan yang perlahan atau tidak lengkap. Itulah keseluruhan isyarat ujian ini.

Dua kaedah bersejarah menggunakan pewarna yang sama tetapi mempunyai titik akhir yang berbeza. Bezakan kedua-duanya, dan kebanyakan kekeliruan akan hilang.

Dua ujian, satu pewarna, titik akhir berbeza

Yang pertama ialah ujian penurunan biru metilena secara langsung, yang diterangkan oleh Sass dan rakan-rakan dan kemudian dinilai oleh Gibbs. Dalam ujian ini, titik akhirnya ialah pewarna itu sendiri: biru metilena teroksida yang berwarna biru diturunkan ke arah bentuk leukometilena biru yang tidak berwarna, dan kadar perubahan itu mencerminkan kapasiti penghasilan NADPH. Makalah utama tentang saringan ini diindeks di PubMed di bawah Sass et al. (1966).

Yang kedua ialah ujian penurunan methemoglobin Brewer. Natrium nitrit mula-mula mengoksidakan hemoglobin menjadi methemoglobin berwarna perang. Biru metilena kemudian bertindak sebagai perantara pemindahan elektron: biru metilena yang telah diturunkan memindahkan ekuivalen penurun kepada methemoglobin, lalu menukarkannya semula menjadi hemoglobin berwarna merah. Oleh itu, titik akhir yang kelihatan ialah perang berbanding merah, bukannya biru berbanding tidak berwarna. Kaedah asal diterbitkan dalam Bulletin of the World Health Organization (Brewer et al., 1960).

Dari segi kimia, menyifatkan asai Brewer sebagai ujian penyahwarnaan pewarna adalah tidak tepat. Pewarna melalui kitaran tindak balas; hemoglobinlah yang berubah warna. Rajah di bawah menunjukkan kedua-dua laluan.

Tindak balas yang mendasarinya

G6PD memangkinkan langkah pengoksidaan pertama dalam laluan pentosa fosfat:

Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+

Sel darah merah matang sangat bergantung pada laluan ini untuk memperoleh NADPH, seperti yang diulas dalam Blood oleh Luzzatto dan rakan-rakan (2020). NADPH mengekalkan glutation dalam bentuk terturun dan melindungi sel daripada kerosakan oksidatif. Biru metilena mengambil bahagian dalam sistem ini sebagai penerima elektron. G6PD yang mencukupi menghasilkan NADPH yang mencukupi, lalu membolehkan penurunan yang cekap. Tahap G6PD yang rendah memutuskan rantaian ini pada pautan pertamanya.

Anggap pewarna itu sebagai tolok bahan api, bukan enjin. Ia memberikan petunjuk tentang bekalan NADPH. Apa-apa faktor lain yang mengubah bekalan itu, atau bacaan ujian, boleh menggerakkan jarum tolok tanpa sebarang perubahan pada gen.

Cara prosedur jenis Brewer dijalankan

Formulasi reagen telah berubah-ubah sepanjang beberapa dekad, maka penerangan untuk tujuan pengajaran tidak boleh dianggap sebagai protokol klinikal. Setiap makmal mengikuti prosedur operasi standard tersendiri yang telah disahkan. Dengan peringatan itu, susunan tabung klasik adalah seperti berikut, sebagaimana didokumentasikan menggunakan tiga tabung dan inkubasi selama 3 jam dalam pelaksanaan yang diterbitkan ini:

1. Tabung pesakit: darah penuh bersama glukosa, natrium nitrit, dan biru metilena. Nitrit menghasilkan methemoglobin, glukosa membekalkan bahan untuk metabolisme sel darah merah, dan pewarna menyediakan perantara pemindahan yang bergantung pada NADPH.
2. Kawalan teroksida: darah bersama nitrit dan glukosa tetapi tanpa biru metilena. Ia menunjukkan titik akhir methemoglobin berwarna perang, iaitu corak kekurangan.
3. Kawalan hemoglobin: darah bersama air. Ia menunjukkan titik akhir hemoglobin berwarna merah, iaitu corak normal.
4. Inkubasikan semua tabung pada suhu sekitar 37 C, lazimnya selama 3 jam, sambil mencampurkannya perlahan-lahan.
5. Cairkan alikuot kecil daripada setiap tabung dalam air suling untuk melisiskan sel dan memudahkan perbandingan warna.
6. Bandingkan tabung pesakit dengan kedua-dua kawalan. Perubahan kembali ke arah merah menunjukkan kapasiti penurunan yang besar. Warna yang kekal cenderung kepada perang menunjukkan kemungkinan kekurangan yang ketara.

Satu formulasi bersejarah menggunakan kira-kira 1 mL darah dengan reagen pada kepekatan sekitar 180 mM natrium nitrit, 280 mM dekstrosa, dan 0.4 mM biru metilena. Anggap angka-angka ini sebagai contoh daripada literatur, bukan spesifikasi sejagat.

Membaca keputusan

Saringan kualitatif paling berkesan membezakan tahap aktiviti sekitar 30 hingga 40 peratus daripada aktiviti normal, seperti yang dibincangkan dalam ulasan Malaria Journal ini tentang jurang pengesanan G6PD. Oleh itu, keputusan saringan yang normal bermaksud asai tersebut tidak mengesan kekurangan yang teruk. Ia tidak mengesahkan bahawa aktiviti enzim adalah sepenuhnya normal.

Mengapa saringan boleh mengelirukan

Retikulositosis selepas hemolisis ialah punca klasik keputusan normal palsu. Sel darah merah muda dan retikulosit mengandungi lebih banyak G6PD berbanding sel tua. Semasa episod hemolisis akut, sel yang paling tua dan paling kekurangan enzim mungkin telah musnah, meninggalkan populasi sel muda yang memberikan keputusan aktiviti normal. Faktor biologi yang sama turut mengelirukan asai kuantitatif, bukan hanya saringan pewarna.

Transfusi baru-baru ini menyamarkan kekurangan kerana sel darah merah penderma menyumbangkan enzimnya sendiri kepada spesimen. Mayo Clinic Laboratories menyenaraikan transfusi sebagai salah satu punca keputusan enzim yang tidak boleh dipercayai, bersama retikulositosis dan gangguan leukosit.

Wanita heterozigot merupakan kes yang paling sukar. Penyahaktifan kromosom X secara rawak menghasilkan campuran sel darah merah normal dan sel yang kekurangan enzim, dan aktiviti keseluruhan boleh berada pada mana-mana tahap, daripada kekurangan teruk hingga kelihatan normal. Saringan kualitatif sering gagal mengesan fenotip pertengahan. Dokumentasi WHO tentang ujian G6PD membincangkan batasan ini secara terperinci.

Usia spesimen, suhu penyimpanan, subjektiviti penilaian titik akhir secara visual, hematokrit, dan kualiti reagen menambahkan hingar analisis selain kesan biologi ini.

Saringan bukan diagnosis

Keputusan saringan yang menunjukkan kekurangan, tahap pertengahan, atau ketidakselarasan dengan keadaan klinikal memerlukan asai enzim G6PD kuantitatif. WHO menganggap spektrofotometri kuantitatif dengan suhu terkawal sebagai pendekatan rujukan. Dalam asai itu, glukosa-6-fosfat dan NADP+ ditambahkan kepada hemolisat sel darah merah, dan NADPH yang terbentuk dipantau melalui peningkatan absorbans pada 340 nm. Kadar perubahan berkadar terus dengan aktiviti enzim, yang biasanya dinormalkan terhadap hemoglobin sebagai unit per gram. Amalan makmal klinikal semasa diringkaskan dalam entri katalog ujian Mayo untuk aktiviti G6PD.

Tafsiran menggunakan julat rujukan yang telah disahkan oleh makmal, lazimnya ditetapkan relatif kepada aktiviti normal populasi, dengan kekurangan biasanya dibincangkan sekitar ambang 30 peratus dan aktiviti pertengahan di atasnya. Profil produk sasaran WHO untuk ujian G6PD (2022) menetapkan kerangka diagnostik tersebut. Jika hemolisis atau transfusi baru-baru ini menjadikan penentuan fenotip tidak boleh dipercayai, ulangi ujian selepas populasi sel darah merah mencapai keseimbangan semula; ujian molekul pula boleh menambah maklumat tanpa menggantikan pengukuran enzim.

Batas yang wajar dikekalkan

Biru metilena dalam asai ini ialah reagen makmal ex vivo. Fakta itu perlu dipisahkan daripada perbincangan tentang keselamatan pemberian biru metilena kepada pesakit, yang dibincangkan dalam panduan tentang kontraindikasi biru metilena. Biokimia menghubungkan kedua-duanya, kerana ubat itu juga bergantung pada penurunan yang bergantung pada NADPH, tetapi pewarna dalam tabung uji bukan dos dalam aliran darah. Untuk konteks tentang cara pewarna ini bertindak sebagai bahan pewarnaan dalam keadaan yang berbeza, lihat prinsip pewarnaan biru metilena, dan untuk keluarga kimianya, pewarna redoks di makmal.

Saringan menilai sama ada kapasiti penurunan kelihatan utuh. Pengesahan menentukan jumlah enzim yang benar-benar ada. Pewarna ini menjawab persoalan pertama dengan baik, asalkan tiada siapa memintanya menjawab persoalan kedua.