Asai yis dengan metilena biru: mengira sel hidup berbanding mengukur masa respirasi

Dua tiub berada di atas meja makmal. Kedua-duanya berwarna biru. Dalam satu tiub, sel biru di bawah mikroskop menandakan yis mati. Dalam tiub yang satu lagi, perubahan daripada biru kepada tidak berwarna menandakan yis masih hidup dan menjalankan respirasi. Pewarna yang sama, tetapi tafsiran yang bertentangan. Jika kedua-dua asai ini dikelirukan, setiap kesimpulan akan terbalik.

Perbezaan inilah yang menjadi teras artikel ini. Metilena biru ialah pewarna redoks: bentuk teroksidanya berwarna biru, manakala bentuk terturunnya ialah leukometilena biru yang tidak berwarna. Kiraan viabiliti memanfaatkan tindak balas kimia itu melalui pemerhatian mikroskopik singkat. Eksperimen respirasi pula memanfaatkannya melalui tindak balas keseluruhan campuran yang diukur masanya. Setiap asai memerlukan protokol, kawalan dan sikap skeptisnya sendiri.

Kiraan viabiliti: pewarnaan singkat, dibaca segera

Protokol gaya kilang bir ialah versi yang paling terpiawai. Sediakan metilena biru 0.01% w/v dalam natrium sitrat 2%, campurkan pada nisbah 1:1 dengan suspensi yis, kemudian periksa campuran selepas sela masa singkat yang tetap. Sela masa yang diterbitkan berbeza-beza, daripada 1 hingga 2 minit dalam buku panduan Brewing Science Institute hingga kira-kira 5 minit dalam protokol penyelidikan, manakala kaedah mikrobiologi wain OIV mewajibkan pemeriksaan dalam tempoh 10 minit. Kepekatan akhir pewarna dalam campuran pengiraan ialah sekitar 0.005%. Isikan kebuk Neubauer yang ditambah baik, kemudian pada pembesaran kira-kira 400x, kelaskan sel biru tua sebagai tidak berdaya hidup dan sel yang tidak berwarna sebagai berdaya hidup. Sel biru muda dikira sebagai hidup dalam kaedah OIV, yang sudah membayangkan masalah subjektiviti yang dibincangkan di bawah.

Kepekatan sel ditentukan daripada geometri kebuk. Apabila keseluruhan petak tengah bersisi 1 mm dikira, bilangan sel per mL bersamaan N darab faktor pencairan darab 10^4, dengan N ialah bilangan sel dalam kawasan itu, seperti yang ditetapkan dalam kaedah yis ASBC. Viabiliti lebih mudah: bilangan sel yang tidak berwarna dibahagikan dengan jumlah sel, darab 100. Kira sekitar 400 sel untuk menganggarkan viabiliti, mengikut kajian perbandingan kilang bir FEMS dan amalan OIV. Gunakan satu peraturan sempadan secara konsisten, contohnya memasukkan sel pada garisan grid bawah dan kiri serta mengecualikan sel pada garisan atas dan kanan.

Peraturan bagi tunas perlu ditetapkan sebelum pengiraan bermula. Konvensyen yang lazim mengira tunas sebagai sel berasingan apabila saiznya mencapai kira-kira separuh saiz sel induk, dan mengiranya bersama sel induk jika lebih kecil daripada itu. Apa-apa peraturan yang dipilih, gunakannya pada setiap petak dan catatkan pada lembaran kerja supaya orang seterusnya dapat mengulanginya.

Lembaran kerja pengiraan (cetak ini)

Lembaran kerja ini ialah bahan asli untuk artikel ini. Salin ke dalam buku nota atau cetak satu bagi setiap sampel.

Viability (%) = 100 x unstained / (unstained + dark blue). Total cells per mL = N x dilution factor x 10^4, dengan N diperoleh daripada kawasan kebuk yang ditetapkan. Catatkan sela masa pewarnaan di sebelah keputusan, kerana nilai viabiliti tanpa masa pengukurannya tidak dapat dihasilkan semula.

Mengapa nilai viabiliti berubah-ubah

Masa ialah gangguan pertama, dan kesannya berlaku dalam kedua-dua arah. Sel yang aktif secara metabolik menurunkan pewarna, jadi bacaan terlalu awal boleh mengesan sel hidup sebelum sel tersebut selesai menurunkannya lalu tersalah mengelaskannya sebagai mati. Namun, pendedahan berpanjangan itu sendiri bersifat toksik dan menghasilkan sel biru yang benar-benar rosak, lalu memberikan petunjuk kematian palsu melalui pewarnaan. Oleh itu, protokol pengajaran makmal menetapkan penilaian dalam tempoh 5 minit, seperti yang didokumenkan dalam protokol pengajaran yis Wisconsin. Rumusan yang selamat ialah penilaian metilena biru bergantung pada masa, jadi tetapkan satu sela masa singkat dan kekalkannya untuk setiap sampel dalam sesuatu siri.

Sampel dengan viabiliti rendah membawa bias kedua. Kaedah terpiawai memberi amaran bahawa metilena biru boleh menganggarkan viabiliti sebenar terlalu tinggi apabila nilainya di bawah kira-kira 80%, kerana sel yang masih menurunkan pewarna tidak semestinya mengekalkan keupayaan membiak. Literatur pembuatan bir menerangkan ketidakandalan yang sama apabila viabiliti merosot dengan ketara. Anggap metilena biru sebagai anggaran kasar yang pantas, dan sahkan keputusan penting berkaitan viabiliti rendah, seperti menggunakan semula kultur sebagai inokulum, dengan kiraan plat atau pewarna pelengkap.

Kesan matriks ialah gangguan ketiga. Kaedah OIV dijalankan pada pH sekitar 4.6 dan memberi amaran bahawa sampel pH rendah dengan penimbal yang kuat menghalang pewarna daripada berfungsi dengan betul. Kaedah itu juga menasihatkan agar asai tidak digunakan apabila kandungan gula melebihi 100 g/L, kerana sel kelihatan biru muda secara mengelirukan. Perbandingan eksperimen terhadap pH pewarnaan mendapati kepekaan berubah dengan ketara merentasi julat yang diuji, selaras dengan kajian kaedah metilena biru yang bergantung pada pH. Serpihan ialah perangkap yang berasingan: zarah berwarna dalam buburan bijirin yang kotor menyerupai sel mati dan meningkatkan variasi antara pengendali.

Variasi itu telah diukur, bukan sekadar berdasarkan anekdot. Dalam percubaan kilang bir selama enam bulan yang dilaporkan dalam perbandingan yis FEMS, ukuran metilena biru pendua mempunyai purata sisihan piawai 6.1%, berbanding 0.2% bagi sitometri aliran oks onol, dengan perbezaan antara dua pengendali sehingga 13 mata peratusan bagi sampel yang sama. Perbandingan kuantitatif kaedah viabiliti pada 2023 mendapati mikroskopi pendarfluor dan sitometri aliran jauh lebih jitu, sambil menunjukkan bahawa prestasi bergantung pada spesies dan matriks. Huraian kaedah klasik oleh Painting dan Kirsop (PMID 24430080) kekal sebagai rujukan utama, dan ulasan lebih luas tentang asai viabiliti dan vitaliti yis (PMID 25154541) meletakkan metilena biru sebagai ujian pelengkap, bukan ujian penentu. Biru tripan bukan pilihan naik taraf secara automatik dalam konteks ini: ia menunjukkan kehilangan integriti membran, manakala metilena biru menunjukkan pengambilan pewarna serta aktiviti penurunan, jadi sel yang mengalami tekanan boleh dikelaskan secara berbeza dengan kedua-dua pewarna tersebut.

Eksperimen respirasi: ukur masa sehingga warna biru hilang

Asai kedua tidak melibatkan pemerhatian melalui mikroskop. Yis, glukosa dan metilena biru cair dimasukkan ke dalam tiub tertutup, dan masa yang diambil untuk warna biru hilang diukur. Semasa sel menjalankan metabolisme, sel menghasilkan ekuivalen penurun yang menukarkan pewarna biru kepada bentuk tidak berwarna, manakala oksigen terlarut mengoksidakannya semula. Apabila sel mengurangkan kandungan oksigen, penurunan bersih mengatasi pengoksidaan semula dan warna dalam tiub hilang. Oleh itu, titik akhir mencerminkan keseimbangan antara respirasi, kepekatan pewarna dan ketersediaan oksigen, dan perlu dilaporkan sebagai masa penurunan atau penyahwarnaan metilena biru, bukan sebagai kadar penggunaan oksigen molekul secara langsung.

Gunakan pewarna yang jauh lebih cair berbanding dalam kerja viabiliti supaya masa pengukuran berada dalam julat yang sesuai. Buku panduan amali wajib AQA A level mempiawaikan prosedur ini dengan baik: 1 g glukosa bagi setiap 100 mL air yang dipanaskan hingga kira-kira 30 C, 5 g yis kering ditambah sejurus sebelum digunakan, dan larutan pewarna kerja sekitar 0.001% yang disediakan dengan mencairkan 0.1 mL larutan stok 1% hingga 100 mL. Campurkan 2 mL suspensi yis-glukosa dengan 2 mL larutan pewarna kerja, biarkan mencapai keseimbangan pada suhu ujian, goncang sekali selama 10 saat, mulakan pemasa, dan jangan goncang lagi. Penggoncangan memasukkan semula oksigen dan menjadikan tiub biru semula; inilah artifak prosedur yang paling besar. AQA menyatakan bahawa sediaan biasanya kehilangan warna dalam kira-kira 5 minit pada 35 C, dengan purata percubaan 275 s pada 20 C, 128 s pada 35 C dan 145 s pada 45 C. Itu ialah contoh daripada satu susunan eksperimen, bukan penanda aras sejagat. Hubungan kuantitatif antara kadar penurunan dengan yis yang aktif secara metabolik dalam keadaan terkawal disokong oleh kajian khusus tentang penurunan, termasuk kajian yang diindeks sebagai PMID 25773544 dan kajian mekanisme dalam Yeast (2014).

Demonstrasi perubahan mengikut masa (bahan asli)

Jadual di bawah ialah demonstrasi asli yang dihasilkan untuk artikel ini menggunakan susunan gaya AQA yang diterangkan di atas: 2 mL campuran yis-glukosa bersama 2 mL larutan pewarna kerja sekitar 0.001%, satu penggoncangan selama 10 saat, kemudian pengeraman tanpa gangguan. Catatan ialah contoh bacaan dalam format yang patut direkodkan oleh kumpulan pelajar, dengan indeks kadar ditakrifkan sebagai 1 dibahagikan dengan masa penyahwarnaan dalam saat. Jalankan eksperimen menggunakan tiub yang sama dan gantikan catatan ini dengan nilai yang diukur.

Plotkan indeks kadar melawan suhu bagi tiub A, B dan C. Lengkung meningkat kemudian mendatar atau menurun, iaitu corak dipacu enzim yang dijangka, bukan garis lurus. Tiub D, E dan F bukan titik data pada lengkung itu. Tiub tersebut ialah kawalan yang membolehkan lengkung ditafsirkan.

Kawalan yang menjadikan setiap asai bermakna

Setiap ujian respirasi memerlukan tiga kawalan pendamping. Yis yang dididihkan atau dimatikan bersama glukosa dan pewarna sepatutnya kekal biru, membuktikan bahawa penurunan pantas bergantung pada metabolisme sel hidup. Yis hidup bersama pewarna tanpa glukosa tambahan ialah kawalan substrat, tetapi penyahwarnaan perlahan masih dijangka kerana yis menggunakan simpanan endogen. Glukosa bersama pewarna tanpa yis ialah blanko kimia, yang penting kerana glukosa beralkali boleh menurunkan metilena biru tanpa kehadiran sebarang sel.

Pengiraan viabiliti memerlukan jenis kawalan yang berbeza: ketekalan prosedur. Gunakan larutan stok pewarna, nisbah campuran, sela masa pewarnaan, kawasan kebuk serta peraturan tunas dan sempadan yang sama, dengan pengiraan dilakukan secara buta jika boleh. Apabila bacaan dua pengendali berbeza sebanyak sepuluh mata peratusan, lembaran kerja biasanya menunjukkan puncanya: masa yang berbeza, ambang warna biru yang berbeza atau peraturan tunas yang berbeza. Teknik menyediakan dan memerhatikan sel berwarna berkaitan dengan kaedah pewarnaan ringkas bakteria, manakala tinjauan lebih luas tentang perkara yang ditandai oleh pewarna ini merentas pelbagai spesimen terdapat dalam atlas pewarnaan mikroskopi. Bagi fizik di sebalik pembacaan sebarang keamatan biru secara kuantitatif, rujukan penyerapan yang dilabelkan mengikut keadaan menerangkan mengapa setiap pekali mesti disertakan dengan keadaan pelarut, pH dan kepekatannya.

Pilih asai berdasarkan soalan. Berapa banyak sel yang hidup sekarang ialah soalan pengiraan, yang dijawab menggunakan mikroskop dan lembaran kerja. Seberapa aktif kultur ini menjalankan respirasi ialah soalan kinetik, yang dijawab menggunakan jam randik dan tiub terkawal. Metilena biru digunakan untuk kedua-duanya, tetapi tidak sekali-kali dalam tiub yang sama pada masa yang sama.