Паул Ерлих и метиленското сино: како една боја помогнала во развојот на откривањето лекови

Придонесот на Паул Ерлих во медицината не бил лек. Бил аргумент за тоа како да се пристапи кон еден лек.

Во 1878 тој поднел докторска дисертација чиј воведен дел бил насловен „Хемиското сфаќање на боењето“. Во неа тврдел дека боењето ткивен пресек и боењето парче ткаенина ја следат истата логика. Во двата случаи бојата се врзува поради хемиски афинитет меѓу неа и материјалот, а не затоа што ткивото е впивливо, масно или има облик што го заробува пигментот. Ерлих пораснал гледајќи како неговиот братучед, патологот Карл Вајгерт, подготвува обоени пресеци, а вниманието не му го задржувале сликите, туку фактот дека бојата избирала каде да оди.

Тврдењето звучи скромно. Не е. Ако бојата се врзува за ткивото од хемиски причини, тогаш образецот на боење дава податоци за хемијата на тоа ткиво. Обоениот микроскопски препарат престанува да биде илустрација и станува мерење.

Тој веднаш ја надградил таа идеја. Во 1880 го комбинирал метиленското сино со кисел фуксин и ја нарекол смесата неутрална боја, неутрално бојно тело, со која можеле да се разграничат различните видови бели крвни клетки, што не било можно со поединечните бои што тогаш се користеле. Две години подоцна претставил метод со метил виолетово за боење туберкулозни бацили, а Кох ја усвоил постапката во својата работа.

Теоријата што подоцна им дала заедничка основа на овие постапки е посебно прашање, а времето на нејзиното настанување често се поедноставува. Теоријата на Ерлих за страничните синџири — идејата дека една супстанција дејствува врз клетката затоа што двете се хемиски компатибилни — потекнува од 1890-тите, а не од годините на неговите истражувања со бои. Поранешната работа го дала претходното уверување: селективноста е хемиска, па затоа може намерно да се бара, наместо случајно да се открие.

Експериментот што ја претворил бојата во карта

Во 1885 Ерлих објавил монографија за потребите на организмот од кислород, со поднаслов „Колориметриско-аналитичка студија“. Методот се состоел во вбризгување бои чија боја зависи од оксидациската состојба, а потоа во споредување на тоа како различни органи ги редуцираат или ги зачувуваат. Бојата се користела како инструмент, слично на термометар: давала податоци за условите во ткивото што не можеле директно да се испитаат. Според самиот Ерлих, целта била со помош на одредени бои да се утврди редукциската моќ на живите органи.

Резултатот со метиленското сино бил објавен во 1886, во труд за реакцијата на бојата со жива нервна материја, прочитан пред медицинско друштво претходниот декември. Метиленското сино било внесено во крвотокот на живо животно, а потоа биле извадени тенки ткивни пресеци и изложени на воздух, така што насобраната безбојна форма на бојата повторно се оксидирала во сино и покажала каде се наталожила. Нервните клетки и нервните влакна се обоиле, и тоа доволно селективно за техниката да стане стандарден метод за прикажување нервно ткиво. Соединението повеќе не било само боја нанесена врз мртов пресек на лабораториска маса. Било маркер што се распределувал во живо тело, а таа распределба можела да се прочита.

Својството врз кое се темелат двата експеримента заслужува јасно да се наведе, затоа што сè друго во оваа приказна зависи од него. Промените на метиленското сино се реверзибилни. Неговата редуцирана форма, леукометиленското сино, е безбојна, а во контакт со кислород повторно се претвора во синиот катјон. Раствор на бојата со гликоза во затворена тегла е безбоен; отворете ја теглата и станува син. Според објавениот опис, Ерлих го покажал тоа директно со третирање обоени пресеци со железен хлорид, како и со воздух, и набљудување на враќањето на бојата. Боја што ја менува својата боја во зависност од редокс-состојбата на околината служи како сонда за таа околина.

Така, две својства се нашле едно покрај друго. Бојата можела да разликува едно ткиво од друго. И бојата можела да се „вклучи“ и „исклучи“ со промена на оксидациската состојба.

Гледано наназад, второто својство е почетокот на хемотерапијата. Ако едно соединение се врзува за еден вид ткиво, но не и за друг, тогаш истото соединение би можело да стигне до еден вид организам, но не и до друг. Ерлих директно го изнел заклучокот: ако патоген може селективно да се обои, боењето би можело да укажува на специфично штетно дејство врз тој патоген. Затоа бојата би можела да се употреби како лек, насочен кон напаѓачот, а не кон пациентот.

Првото испитување кај пациент не било за маларија. Во 1890, заедно со психијатарот Артур Лепман, Ерлих известил дека метиленското сино ја ублажувало болката при невралгични и ревматски состојби на мускулите, зглобовите и тетивите. Двајцата разговарале дали лекот би можел да дејствува врз ментални заболувања и одлучиле да не го испробуваат. Италијанскиот лекар Пјетро Бодони од Џенова сепак продолжил со тоа. Неговиот труд од 1899 во насловот се однесува на седативно дејство кај различни форми на психоза: тој опишал смирување кај четиринаесет вознемирени пациенти и забележал дека други лекари во Џенова веќе ја користеле бојата за истата цел. Седацијата не е дејство врз самото заболување, а оваа разлика постојано се појавува во оваа историја.

Истражувањето за маларија следело во 1891, со патологот Паул Гутман, во болницата Моабит во Берлин. Метиленско сино им било дадено на двајца пациенти, а извештајот бил објавен во Berliner klinische Wochenschrift од 28 септември 1891. Во првиот случај пациентот одеднаш зел 0.5 g од бојата вечерта на 29 јуни; очекуваниот напад не се развил целосно, а единствената поплака забележана потоа била блага странгурија со сина урина. Нападите на треска исчезнале во првите денови, а паразитите исчезнале од крвта најдоцна до осмиот ден. Според резимето на самите автори, нивните очекувања биле целосно исполнети. Два случаи без контролна група не се доказ. Подеталниот приказ за метиленското сино и маларијата, вклучително и современите испитувања, е на посебна страница, а интересното прашање овде е потесно: колкав дел од расудувањето на Ерлих ја издржал проверката во контакт со паразитот.

Каде расудувањето се потврдило, а каде потфрлило

Од предложениот механизам не се потврдило многу, барем не во обликот што го предложил Ерлих. Уредното објаснување, според кое рамен трицикличен катјон се вметнува меѓу базните парови на ДНК на паразитот, не се потврдува кај Plasmodium. Инфицираната црвена крвна клетка толку лесно го редуцира метиленското сино што тоа воопшто не стигнува до паразитот како планарен катјон, а објаснувањето со интеркалација што важи за акридинските бои не важи за оваа.

Она што го поткрепуваат доказите е посложено. Метиленското сино ја инхибира глутатион редуктазата на паразитот при концентрации што можат да се постигнат кај пациент. Ја блокира претворбата на хемот во хемозоин — инертниот пигмент што паразитот го создава за да не се отруе од сопственото разградување на хемоглобинот — приближно подеднакво ефикасно како хлорокинот и многу поефикасно од кининот. Неговото редокс-циклирање создава и реактивни кислородни видови во клетка што веќе ги создава. Сè уште не е разјаснето кој од овие механизми е вистинскиот, или дали сите придонесуваат.

Постои дополнителна сложеност, која треба да влијае врз читањето на секое историско тврдење за ова соединение. Комерцијалното метиленско сино од тој период не било една супстанција. Примероците содржеле azure B, монодеметилираниот сродник, а во постарите раствори се насобирало повеќе од него. Azure B е метахроматска боја со различни цели: ја бои двоверижната ДНК темносино, а РНК зелено. Смеса од две бои што се распределуваат на различни места, во соодноси што никој не ги евидентирал, не може да поткрепи недвосмислено тврдење за тоа што направило метиленското сино во неа.

Самата боја никогаш не го заменила кининот. Методот поминал подобро. Ученикот на Ерлих, Вилхелм Рел, кој работел за концернот за бои и лекови IG Farben, продолжил да ги истражува дериватите на бои како лекови за тропски заболувања и ја обезбедил алатката што недостасувала: канаринец заразен со птичја маларија, како рутински модел за скрининг на кандидат-соединенија. Вернер Шулеман потоа го изменил страничниот синџир, а добиената фенотиазиниумска сол ја излекувала експерименталната инфекција. Таа и понатаму ги обојувала пациентите сино.

Се покажало дека трајниот резултат не била ниту бојата ниту прстенестиот систем, туку страничниот синџир. Додавањето диалкиламиноалкиламино група го променило однесувањето на молекулата, а тој фрагмент останал при секое подоцнежно редизајнирање. Ако се задржи таа група, а фенотиазиниумскиот прстен се замени со акридински, резултатот е хинакрин. Ако се замени со хинолински, резултатот е хлорокин. Памаквинот, примаквинот и амодиаквинот, кои сè уште се во каталогот на антималарици, ја содржат истата група. Соединението што не успеало како терапија го дало делот што успеал.

Врската со антипсихотиците оди преку прстенот, а не преку лекот. Разјаснувањето на структурата на метиленското сино го довело Хајнрих Аугуст Бернтсен до основното фенотиазинско јадро во 1883, а токму на тој скелет, со различни супституции, работеле хемичарите во Rhône-Poulenc во 1940-тите, додека барале антихистаминици. Едно од тие соединенија било синтетизирано кон крајот на 1950 и испитано од хирургот Анри Лабори, кој забележал дека ги оставало пациентите смирени и рамнодушни. Неговата прва објавена психијатриска употреба, кај пациент со манија, била во јануари 1952. Првиот антипсихотик не е толку наследник на антималарикот на Ерлих, колку далечен сродник на бојата со која тој започнал.

Три навики што вреди да се задржат од оваа епизода

1. „Прв синтетички лек употребен во медицината“ опишува категорија, а оградите се поголеми отколку што сугерира изразот. Изразот се одомаќинил; често цитираниот преглед на Ширмер и соработниците во Neurobiology of Aging го нарекува метиленското сино првиот целосно синтетички лек употребен во медицината. Хлорал хидратот бил воведен како синтетички седатив во 1869, повеќе од дваесет години порано. Самиот труд од 1891 дава дел од одговорот, бидејќи неговите автори ги именуваат синтетичките антипиретици што веќе не успеале против маларијата, меѓу нив хинолинот, антипиринот и антифебринот. Арсенскиот препарат на самиот Ерлих за сифилис се појавил уште подоцна. Одржливата верзија на тврдењето се однесува на методот, а не на првенството: метиленското сино е меѓу најраните синтетички соединенија избрани да дејствуваат против конкретен организам врз основа на хемиска теорија за селективност.
2. Селективната распределба не значи селективна корист. Резултатот на Ерлих од 1886 бил дека бојата оди во нервното ткиво. Каде оди едно соединение и што прави кога ќе стигне таму се две различни мерења, а првото е многу полесно да се изведе. Во тој јаз оттогаш се сместуваат повеќето тврдења за метиленското сино и мозокот.
3. Чистотата е дел од доказите, а не од маркетингот. Историските податоци се двосмислени токму поради ова. Малите структурни разлики го менуваат местото каде оди ова соединение, поради што сертификатот за анализа мора да биде поврзан со конкретна серија, наместо да се нуди како општа изјава дека производот е тестиран. Продавач што тврди усогласеност со фармакопејската монографија, а тестира само тешки метали, тврди повеќе отколку што поткрепува извештајот. Blupreme набавува метиленско сино од фармацевтски производител и ја тестира целосната спецификација утврдена во монографијата: идентитет, чистота, органски нечистотии, резидуални растворувачи, елементни нечистотии, остаток по жарење, микробиолошки граници и бактериски ендотоксини. Извештајот е објавен заедно со производот, а страницата за метиленско сино со USP квалитет ги објаснува тие граници и зошто резултатот за azure B е првиот што треба да се побара.

Хронолошка трага на изворите

Хронолошката низа на пресвртници, вклучително и хемијата на боите пред Ерлих и степените на квалитет и спецификациите по него, е изложена одделно во историјата на метиленското сино, а идентитетот на самото соединение е обработен во што е метиленско сино.

Илустративните табли врз кои се темели овој приказ, репродуцирани во прегледот од 2012 на Крафтс, Хемпелман и Скорска-Стања, немаат еднаква доказна вредност, а еден пример покажува зошто. Таблата од 1891 е примарниот запис за испитувањето; портретот од 1910 покрај неа само ја датира репутацијата и ништо повеќе. Страниците од бележникот на Андерсаг од 1934 се директна трага на хинолинската супституција, запишана со раката на самиот хемичар.

Искреното резиме на експериментите на Ерлих со бои е дека точно ги определил селективноста и целта, но го промашил механизмот. Метиленското сино навистина се концентрира во нервното ткиво и навистина му штети на маларијалниот паразит. Второто не го прави поради првото, а хемиското објаснување што го понудил за двете било погрешно. Она што неспорно го покажал било потрајно од точен механизам: едно соединение може намерно да се избере, наместо случајно да се најде, и тоа врз основа на докази собрани пред некој да му го даде на пациент.