Како метиленското сино влегува во клетките: редукција, реоксидација, внесување

Ако набљудувате сад со ендотелни клетки што внесуваат метиленско сино, очигледното толкување истовремено е и погрешно. Медиумот ја губи сината боја, клетките добиваат сини гранули, па се чини дека бојата морала да помине низ мембраната како сина молекула. Експериментите покажуваат поинаку. Сината форма едвај поминува. Она што поминува е безбојната форма, а сината боја што ја гледате внатре се создава таму, по влегувањето.

Овој пресврт е важен затоа што одредува што може, а што не може да ви каже боењето. Сините гранули покажуваат оксидирана боја што била реоксидирана и задржана во органелите. Тие не ја покажуваат вкупната количина боја во клетката, не ја покажуваат редуцираната фракција и не го мерат биолошкиот ефект. За да разберете зошто, следете ги трите чекори: редукција на површината, дифузија на редуцираната форма, реоксидација и задржување внатре.

Двете форми се однесуваат како различни молекули

Оксидираното метиленско сино е рамен, позитивно наелектризиран прстенест систем. Се раствора во вода, силно апсорбира светлина во опсегот од околу 600 до 700 нанометри и изгледа сино. Клучен е полнежот. Наелектризирана, хидрофилна молекула не поминува лесно низ липидна мембрана, па внимателната формулација во литературата е релативно непропустлива низ мембраната, а не непропустлива.

Редуцираното метиленско сино, наречено леукометиленско сино, е безбојно, без електричен полнеж и растворливо во масти. Отстранете го полнежот и мембраната престанува да биде ѕид. Редуцираната молекула лесно дифундира низ неа, а кога ќе се најде во компартман со пооксидирачки услови, може повторно да изгуби електрони и да се врати во сината, наелектризирана, задржана форма. Затоа редокс-хемијата на бојата е и нејзин транспортен механизам. Со промена на бројот на електрони се менува и пропустливоста.

Електроните за првиот чекор потекнуваат од самата клетка. Клетките на цицачите вршат електронски транспорт низ плазматската мембрана, пренесувајќи редукциски еквиваленти од внатреклеточни донори кон надворешни акцептори на површината. Оваа трансплазмамембранска активност е нормална клеточна функција, присутна кај повеќето типови клетки, а површинската редуктаза на ендотелот што ги обработува тијазинските бои се однесува како другите во еден показателен поглед: продолжува да работи во присуство на цијанид и азид во дози што ги запираат подоцнежните чекори. Ова раздвојување е клучот за целата приказна.

Распределбата меѓу фазите беше прва и речиси го објасни внесувањето

Во 1929, Маријан Ирвин од Институтот Рокфелер поставила поедноставно прашање. Можеби влегувањето на бојата е само распределба меѓу водата и масните слоеви на клетката, а слој од хлороформ може да ги замени тие масни слоеви во лабораториски услови. Во своите спектрофотометриски испитувања на продирањето, таа протресувала водни раствори на бои со хлороформ и споредувала што преминува во органската фаза со она што влегува во живи клетки на алги.

Два наода од таа работа сè уште заслужуваат внимание. Прво, комерцијалните раствори на метиленско сино содржеле триметилтионин, денес наречен azure B, а оваа нечистотија продирала побрзо од самото метиленско сино, особено при алкална pH, кога преовладува липидно растворливата форма на слободна база. Дел од привидното влегување на метиленското сино всушност бил селективно влегување на azure B. Второ, pH го одредувала исходот преку состојбата на јонизација, а оштетените клетки пропуштале многу повеќе боја од неоштетените. Коефициентите на распределба и состојбата на полнежот одредувале што апсорбираат вештачкиот систем и живата клетка, а сличноста меѓу нив ја поткрепувала идејата за неводни слоеви на клеточната граница.

Моделот дал далекувидно објаснување за липидите и јонизацијата, но не можел да разликува боја што се распределува во својата првобитна форма од боја што хемиски се претвора на површината, поминува во изменета форма и внатре повторно се претвора во првобитната. За таа разлика бил потребен поинаков експеримент, кој се појавил седумдесет години подоцна, во белодробниот ендотел.

Редукција надвор, задржување внатре

Меркер и соработниците работеле со култивирани ендотелни клетки од белодробните артерии на говеда и предложиле низа од три чекори: оксидираната боја се редуцира на клеточната површина во својата безбојна липофилна форма, редуцираната форма дифундира навнатре, а внатреклеточната реоксидација ја обновува оксидираната форма што не поминува низ мембраната и затоа се натрупува. Потоа, во своето испитување на внесувањето тијазински бои во ендотелот, ја провериле оваа низа обидувајќи се да ја прекинат на точно определени места.

Првото средство бил ферицијанидот, акцептор на електрони што не може да влезе во клетката. Кога површинските ензими ја редуцираат сината боја во нејзината безбојна форма надвор од клетката, ферицијанидот може да ги преземе тие електрони назад и да ја обнови сината боја во медиумот уште пред таа да помине низ мембраната. Сè додека ферицијанидот бил присутен во вишок (10 микромолари боја наспроти 50 до 500 микромолари ферицијанид), внесувањето на бојата речиси запирало, а дури откако ферицијанидот ќе се потрошел, внесувањето продолжувало со својата нормална брзина. Кинетиката ја потврдила истата приказна и на друг начин. Ферицијанидот исчезнувал со приближно константна брзина, што било во согласност со постојан површински редукциски тек што снабдува посредник кој може повторно да се користи, додека вонклеточната боја исчезнувала експоненцијално како што се исцрпувала нејзината залиха. Константен тек заедно со залиха што се исцрпува значи дека сигналот од ферицијанидот покажува континуирана редукција, а не молекули на боја што го напуштаат растворот.

Второто средство целосно го отстранило чекорот на преминување. Групата го врзала толуидинското сино O, близок тијазински сродник, за голем полиакриламиден синџир, преголем за да влезе во клетката во која било оксидациска состојба. Клетките сепак ја редуцирале врзаната боја. Значи, за редукцијата не е потребен внатреклеточен пристап. Механизмот е изложен на површината или електрично поврзан со неа.

Потоа дошло раздвојувањето по кое трудот го добил својот наслов. Цијанидот и азидот во концентрација од 2 милимолари силно го потиснале натрупувањето на бојата, а под микроскоп темносините и виолетовите инклузии што вообичаено го опкружуваат јадрото речиси исчезнале. Сепак, ниту еден од инхибиторите не ја забавил вонклеточната редукција: циклусот на ферицијанидот продолжил со несмален интензитет, а полимерот што не поминува низ мембраната и натаму се редуцирал. Блокадата била во подоцнежните чекори. Цијанидот и азидот ја запирале внатреклеточната реоксидација и секвестрација, а не површинската редукција. Контролите на вијабилноста го поткрепиле ова толкување, бидејќи клетките го задржале својот цитозолен маркерски ензим лактат дехидрогеназа при овие третмани, па губењето на внесувањето не било само последица на труење или кинење на мембраната.

Една забелешка од трудот сè уште важи. Сините инклузии биле околу јадрото, но не во него, што е во согласност со оксидација во потклеточни органели, но студијата не утврдила за кои органели станува збор. Слични обрасци кај други типови клетки биле опишувани како лизозомски врз основа на слаби докази. Сметајте го задржувањето за потврдено, а неговата локација за привремено одредена. Читателите што следат каде одат електроните понатаму можат да продолжат со митохондрискиот електронски транспорт и редокс-процесите и со пошироката слика за апсорпцијата и распределбата според патот на внесување.

Боењето не е изложеност

Трета студија покажува што се случува кога оваа логика на внесување ќе се поврзе со биолошки показател. Скот и соработниците откриле дека метил-бета-циклодекстринот, шеќерна структура во облик на торус, директно го врзува метиленското сино, со константа на асоцијација од околу 310 по молар за инклузиониот комплекс, наспроти околу 5846 по молар за димеризацијата на бојата. Во фибробластите L929, ова врзување ги блокирало и боењето на клетките и стимулирањето на внесувањето гликоза: претходната инкубација со циклодекстринот го спречила синото боење, а неговото додавање потоа го забрзало обезбојувањето. Како што оптичкиот син сигнал исчезнувал од клетките, активираниот транспорт на гликоза се намалувал во тесна паралела со него.

Авторите ја протолкувале оваа корелација како показател што повеќе оди во прилог на директна интеракција меѓу бојата и протеин во патеката на активирање на транспортерот за гликоза, отколку на механизам на долготраен оксидативен стрес. Тој заклучок е разумен, но има ограничувања. Експериментот не го идентификува протеинот, не покажува врзување за самиот транспортер, а корелацијата меѓу обезбојувањето и губењето на ефектот не може да ја исклучи секоја патека посредувана од редокс-процеси.

Трајната поука се однесува на мерењето. Оптичкото боење покажува видлива, оксидирана боја поврзана со клетките. Целосно ја пропушта безбојната редуцирана фракција, па бледа клетка и натаму може да содржи еквиваленти на бојата, а интензивно обоена клетка покажува задржана оксидирана боја, наместо вкупна изложеност на ткивото или големина на ефектот. Истото предупредување важи и на пошироко ниво: споредувањето на боењето меѓу различни типови клетки или сметањето на темен ткивен пресек за доказ за поголема изложеност ја повторува првичната грешка од садот. Внесувањето е циклус на редукција, дифузија и реоксидација, а секоја поединечна снимка на сината форма прикажува само еден негов дел. Практичните последици за лабораториското боење и ракување и за толкувањето на тврдењата за дозата и изложеноста произлегуваат директно од тоа.