Metilēnzilā identificēšana laboratorijā: infrasarkanie spektri un papildinošas metodes

Iedomājieties, ka trīs laboratorijas saņem vienu un to pašu zilo pulveri. Pirmā reģistrē infrasarkano spektru un atzīst to par metilēnzilo. Otrā veic hromatogrāfisko analīzi un ziņo par 0.4% Azure B. Trešā veic kristālu rentgendifrakcijas analīzi un nosaka hidrāta formu. Visām trim ir taisnība, un neviena nav atbildējusi uz pārējiem diviem jautājumiem. Neskaidrības sākas, kad vienu rezultātu uztver kā atbildi uz visiem trim.

Šajā rakstā šie jautājumi ir nodalīti. Infrasarkanā identificēšana nosaka molekulāro identitāti, salīdzinot ar references standartu. Hromatogrāfija nosaka sastāvu. Difrakcija nosaka cietvielas formu. Identifikācijas pārbaudē konstatēta atbilstība nav tīrības sertifikāts.

Infrasarkanā identificēšana labi atbild uz vienu jautājumu

Metilēnzilā farmakopejā noteiktā identifikācijas pārbaude ir spektra salīdzināšana ar standartu, nevis spektra maksimumu kontrolsaraksts. USP metilēnzilā monogrāfijas priekšskatījumā identifikācijas pārbaude A paredz infrasarkano spektroskopiju, izmantojot ATR optiku vai kālija bromīda tableti. Parauga spektram jāatbilst USP references standarta spektram, un paraugs un standarts jāsagatavo un to spektri jāreģistrē līdzvērtīgos apstākļos. Izšķirošs nav kāds noteikts diagnostisko viļņu skaitļu saraksts. Izšķiroša ir spektru pārklāšanās.

Šāda pieeja atspoguļo metilēnzilā FTIR spektru īpatnības. Izteiktākās pazīmes atrodas pirkstu nospiedumu apgabalā. Literatūrā galvenā konjugēto gredzenu josla konsekventi tiek novietota ap 1590 līdz 1600 cm-1, kur savstarpēji saistās aromātisko oglekļa–oglekļa un oglekļa–slāpekļa saišu stiepšanās svārstības. Citas joslas ap 1490 un 1390 cm-1 raksturo gredzenu, oglekļa–slāpekļa un oglekļa–ūdeņraža deformācijas svārstības. Joslas ap 1355 un 1330 cm-1 ietver dimetilaminogrupu oglekļa–slāpekļa saišu svārstības un metilgrupu deformācijas. Pazīmes ap 1225 līdz 1250 cm-1 attiecas uz heterociklisko struktūru, savukārt joslām ap 1170 līdz 1130 un 1066 cm-1 piemīt oglekļa–sēra saišu svārstību raksturs; aromātisko C-H saišu lieces svārstības atrodas ap 880 cm-1. Stiepšanās svārstības parādās pie lielākiem viļņu skaitļiem: aromātisko C-H saišu svārstības ap 3040 cm-1 un N-metilgrupu C-H saišu svārstības aptuveni no 2900 līdz 3000 cm-1. Publicētie joslu attiecinājumi detaļās atšķiras, jo fenotiazīnija skelets svārstās kā savstarpēji saistīta sistēma, tāpēc jebkura atsevišķa attiecinājumu tabula jāuztver kā konkrētā avotā aprakstīta, nevis vienīgā iespējamā interpretācija.

Uzmanība jāpievērš diviem parauga sagatavošanas faktoriem, jo tie maina metilēnzilā IR spektrus, nemainot pašu krāsvielu. Pirmkārt, hidratētam materiālam ir plata O-H josla ap 3300 līdz 3500 cm-1 un ūdens lieces svārstību josla ap 1630 līdz 1640 cm-1, turklāt dažādas hidrātu formas izmērāmi nobīda pirkstu nospiedumu apgabala joslas. Otrkārt, KBr tabletes matrica ir higroskopiska: absorbētais mitrums rada joslas tieši šajos ūdens apgabalos un var tikt kļūdaini uzskatīts par parauga hidrāta ūdeni. ATR mērījumos KBr matrica nav vajadzīga, taču ATR joslu intensitāte mainās līdz ar iespiešanās dziļumu, kas ir atkarīgs no viļņu skaitļa, tāpēc viena un tā paša pulvera ATR spektru un caurlaidības spektru nevar tieši pārklāt. No farmakopejas prasības izriet praktisks noteikums: salīdziniet paraugu un references standartu, kuru spektri reģistrēti ar vienu un to pašu metodi, un dokumentējiet izmantoto metodi. Par katjona, sāls un hidrātu ķīmiju, kas nosaka šos spektrus, lasiet metilēnzilā struktūras un īpašību uzziņu rakstā.

Analītiskās metodes izvēles tabula

Šī tabula ir metodes izvēles rīks. Lasiet katru rindu horizontāli, lai noskaidrotu, uz kādu jautājumu metode atbild, ko apliecina atbilstošs rezultāts un kas paliek nepierādīts.

Kāpēc infrasarkano spektru sakritība nav tīrības sertifikāts

Identifikācijas pārbaudē konstatēta sakritība izslēdz nepareizu krāsvielu. Tā nenosaka visu parauga sastāvu. Svarīgākie ir trīs ierobežojumi.

Pirmkārt, tuvu radniecīgu savienojumu infrasarkanie spektri ir līdzīgi. Azure B no metilēnzilā atšķiras ar vienu metilgrupu, tāpēc tā spektrs ļoti līdzinās metilēnzilā spektram. Maisījuma, kurā ir daži procenti Azure B, spektrs joprojām labi pārklājas ar metilēnzilā references spektru. Šā piemaisījuma noteikšana ir hromatogrāfijas uzdevums, kas apskatīts metilēnzilā piemaisījumu un testēšanas metožu ceļvedī.

Otrkārt, infrasarkanā spektroskopija analizē paraugu kopumā, un tās jutība pret nelielā daudzumā esošiem komponentiem ir ierobežota. Nelieli radniecīgu krāsvielu, šķīdinātāju atlikumu vai neorganisku atlikumu daudzumi paslēpjas zem galvenajām joslām. Papildu maksimumu neesamība ir vājš pierādījums piemaisījumu neesamībai.

Treškārt, visu salīdzinājumu nosaka references standarts. Noārdījies, hidratācijas dēļ spektrāli nobīdīts vai nepareizi apstrādāts standarts maina salīdzinājuma pamatu. Tāpat to maina nesaderīgu metožu izmantošana, piemēram, ATR parauga spektra vērtēšana pret KBr references spektru. Līdz ar katru slēdzienu reģistrējiet standarta partiju, metodi un sagatavošanas procedūru.

Maisījumi prasa vēl vienu piesardzības apsvērumu. Spektrs, kas lielākoties sakrīt, bet kuram ir pleci vai intensitātes anomālijas, nav atbilstošs rezultāts ar piebildēm. Tas ir signāls pirms identificēšanas atdalīt parauga komponentus.

Papildinošās metodes praksē

Metilēnzilā HPLC analīze sniedz atbildi par sastāvu, ko infrasarkanā spektroskopija nevar sniegt. Pašreizējā farmakopejas metode izmanto feniltipa kolonnu ar ūdens un acetonitrila gradientu, kas satur trifluoretiķskābi, un detektēšanu pie 246 nm, nevis redzamās gaismas apgabalā. Identitāti nosaka pēc aiztures laika atbilstības references standartam; tas pats salīdzinājums nodrošina satura noteikšanu. Organisko piemaisījumu pārbaudē Azure B identificē, izmantojot tam paredzētu references materiālu, pie relatīvā aiztures laika ap 0.8 attiecībā pret metilēnzilo pie 1.0, un starp abiem pīķiem tiek prasīta augsta izšķirtspēja. Pievērsiet uzmanību viļņa garuma izvēlei: demetilēšanas virknes absorbcija pakāpeniski pārbīdās uz spektra sarkano daļu — no tionīna ap 600 nm caur Azure C, Azure A un Azure B līdz metilēnzilajam ap 670 nm. Tāpēc detektors, kas iestatīts ap 660 nm, uz šīs virknes savienojumiem reaģē nevienādi un dažu homologu daudzumu novērtē par zemu. Ja nepieciešama pilnīga visas virknes profilēšana, jāizmanto C18 LC-MS/MS metode ar kvalificētiem standartiem katram analītam.

Pulveru difrakcija atbild uz jautājumu par cietvielas formu, kuras informāciju abas iepriekš minētās metodes vai nu iznīcina, vai neņem vērā: pulvera izšķīdināšana hromatogrāfijai izdzēš informāciju par kristāliem, savukārt molekulārās svārstības raksturo saites, nevis sakārtojumu tālā kārtībā. Difrakcijas ainas ļauj atšķirt hidrātu fāzes un noteikt kristāliskumu, un metilēnzilajam šāda izpēte ir vajadzīga vairāk nekā vairumam materiālu. Rager un kolēģu pētījumā par cietvielas struktūru tika identificētas piecas atšķirīgas hidrātu struktūras, tostarp pentahidrāts, divi dihidrāti, monohidrāts un starphidrāts, bet starp raksturotajām formām netika atrasts īsts trihidrāts. Šeit svarīga ir rīcība laboratorijā: mitrums un temperatūra maina hidrātu stabilitāti, un intensīva malšana var izmainīt fāzi vai mazināt kristāliskumu, tāpēc kontrolējiet un dokumentējiet relatīvo mitrumu un temperatūru un samaziniet malšanu līdz minimumam. Hidrātu marķējums un tā ietekme uz iesvērto masu plašāk aplūkota rakstā metilēnzilā hidrātu formas un marķējums.

UV-Vis absorbcijai ir papildinoša loma. Zināmie maksimumi apstiprina paredzamo šķīduma uzvedību un ļauj noteikt koncentrāciju, taču zils šķīdums, kas absorbē pie paredzētā viļņa garuma, ir saderīgs ar metilēnzilā klātbūtni, to nepierādot, jo radniecīgas krāsvielas absorbē līdzīgos viļņu garumos.

Ko jautāt pirms iegādes

Pārvērtiet šīs atšķirības jautājumos, ko uzdot pirms pirkuma. Jautājiet, kura partija tika pārbaudīta, ar kuru metodi noteikta identitāte, vai HPLC piemaisījumu pārbaudē izmantots Azure B references materiāls un vai hidrāta forma tika raksturota vai tikai pieņemta. Galvenais — jautājiet, vai sertifikāts aptver visu specifikāciju vai tikai atsevišķas pārbaudes. Daudzi pārdevēji, kas apgalvo atbilstību farmakopejai, pārbauda tikai smagos metālus, atstājot neatbildētus jautājumus par identitāti, saturu, organiskajiem piemaisījumiem, šķīdinātājiem un mikrobioloģiskajiem rādītājiem.

Blupreme sadarbībā ar metilēnzilā farmaceitisko ražotāju veic pārbaudes atbilstoši pilnai USP specifikācijai, aptverot identitāti, tīrību, organiskos piemaisījumus, šķīdinātāju atlikumus, elementu piemaisījumus, atlikumu pēc izdedzināšanas, mikrobioloģiskās robežvērtības un baktēriju endotoksīnus. Katras partijas publiskais analīzes sertifikāts ir publicēts lapā Blupreme kvalitātes pārbaudes, tāpēc satura aprēķina pamatu un piemaisījumu rezultātus var izlasīt tieši, nevis izsecināt. Arī rezultātiem ap 100% jānorāda aprēķina pamats, kā skaidrots ceļvedī par saturu virs 100 procentiem. Identitātes sakritība sāk izpēti. Pilna dokumentācija to noslēdz.