Skruosto ląstelių dažymas metileno mėlynuoju: ką stebėti

Mokinė užlašina skruosto ląstelių suspensijos lašą ant objektinio stiklelio, pažvelgia pro mikroskopą ir beveik nieko nemato. Šviesiame regėjimo lauke plaukioja keli blyškūs šešėliai. Ji tikslina fokusą, tada padidina apšvietimą ir galiausiai nusprendžia, kad stiklelis tuščias. Stiklelis nėra tuščias. Ląstelės ten yra. Jos beveik skaidrios, o būtent skaidrumas yra problema, kuriai spręsti ir naudojamas šis dažymas.

Šį lūkesčių ir vaizdo neatitikimą verta įvardyti dar prieš pradedant darbą pagal protokolą. Pradedantieji tikisi, kad mikroskopas atskleis detales taip, kaip fotoaparato priartinimas leidžia perskaityti tolimą iškabą. Šviesaus lauko mikroskopo veikimas siauresnis: jis parodo šviesos sugerties skirtumus. Nedažyta skruosto ląstelė beveik nesugeria šviesos, todėl beveik nesukuria jokio skirtumo. Metileno mėlynasis tą skirtumą sukuria. Jis netolygiai prisijungia ląstelės viduje ir paverčia struktūrą kontrastu. Mokiniams supratus šią sąvoką, kiekvienas tolesnis žingsnis atrodo kaip jos pasekmė, o ne receptas.

Čia praverčia žinios apie tai, kaip paprastasis dažymas padidina kontrastą mokyklos laboratorijoje, o šviesaus lauko mikroskopo paruošimo prieš dažymą pakartojimas padeda išvengti pusės nepavykusių preparatų. Spalvos cheminis pagrindas aptariamas įvade į metileno mėlynojo naudojimą mikroskopijoje, kuriame paaiškinama, kodėl būtent šis dažiklis taip dažnai naudojamas laboratorijoje.

Protokolas pamokai

Toliau aprašytas drėgnasis preparatas yra paprastesnis įprastoms pamokoms tinkantis variantas. Jam nereikia nei liepsnos, nei fiksavimo etapo. Kai kuriuose aukštųjų mokyklų vadovuose naudojamas fiksuoto tepinėlio variantas papildomai numato džiovinimą ore ir trumpą fiksavimą kaitinant, kaip „North Central Texas College“ skruosto tepinėlio užduotyje, paskelbtoje „Biology LibreTexts“, tačiau fiksavimas kaitinant yra įprasta mikrobiologijos praktika, o ne būtina sąlyga epitelio ląstelėms pamatyti.

Ko reikės: švarių objektinių ir dengiamųjų stiklelių, sterilių vienkartinių tamponėlių (pageidautina) arba naujų plokščių dantų krapštukų, buteliuko su lašintuvu ir 0.5 iki 1 procento vandeniniu metileno mėlynojo tirpalu, distiliuoto arba dejonizuoto vandens, sugeriamojo popieriaus, pirštinių ir sudėtinio mikroskopo, kurio bendras didinimas yra 100x ir 400x.

1. Praskalaukite burną paprastu vandeniu. Taip pašalinamos maisto dalelės, kurios vėliau intensyviai nusidažo ir atitraukia dėmesį nuo ląstelių.
2. Kiekvienas mokinys ima mėginį tik iš savo skruosto. Nauju steriliu tamponėliu švelniai patrinkite vidinę skruosto pusę. Spauskite, o ne grandykite. Baikite gerokai anksčiau, nei atsirastų bet koks diskomfortas ar kraujavimas.
3. Voliodami tamponėlį per švaraus objektinio stiklelio centrą, paskleiskite ploną sluoksnį. Plona plėvelė yra svarbiausias veiksnys, lemiantis, ar preparatą bus galima aiškiai įžiūrėti. Storas baltas sluoksnis nusidažys ir virs neįžiūrima mėlyna mase.
4. Ant tepinėlio užlašinkite vieną metileno mėlynojo lašą. Palikite 1 iki 3 minučių. Daugelyje aukštųjų mokyklų protokolų pakanka vienos minutės; NCERT IX klasės gamtos mokslų laboratorinių darbų vadove laikinajam preparatui skiriama apie 3 minutes. Ilgiau nereiškia geriau, o per ilgas dažymas yra dažniausia laiko parinkimo klaida.
5. Atsargiai nuskalaukite distiliuotu vandeniu arba sugeriamuoju popieriumi pašalinkite dažiklio perteklių, laikydamiesi vietinio protokolo. Fonas turėtų tapti blyškiai mėlynas, o ne sodriai tamsiai mėlynas.
6. Nuleiskite dengiamąjį stiklelį kampu, kad pirmiausia prisiliestų vienas kraštas, tada lėtai nuleiskite likusią dalį. Taip išvengsite oro burbuliukų.
7. Pradėkite nuo mažo didinimo, kad rastumėte ląsteles, patikrinkite fokusą ir vaizdo centravimą, tada pereikite prie 100x ir galiausiai 400x. Didindami 400x naudokite tik tiksliojo fokusavimo sraigtą.

Dažiklio koncentraciją verta tiksliai aptarti bent vienu sakiniu. Mokykliniuose protokoluose dažniausiai naudojamas maždaug 1 procento vandeninis metileno mėlynojo tirpalas. Koncentruotesnis pradinis tirpalas arba ilgas dažymas foną patamsina greičiau nei branduolį, todėl kontrastas, nuo kurio priklauso ši užduotis, tampa priešingas norimam.

Saugus skruosto mėginių tvarkymas

Skruosto mėginiuose yra seilių ir įprastų burnos mikroorganizmų, todėl kiekvieną šviežią tepinėlį laikykite galimai užkrečiama medžiaga, net jei mėginius pateikę bendraklasiai yra sveiki. Amerikos mikrobiologijos draugijos biologinės saugos gairėse mokomosioms laboratorijoms pateikiami bendrieji principai: prieš pamoką įvertinti riziką, mūvėti pirštines, saugoti akis, kai galimas taškymasis, po darbo nusiplauti rankas, dezinfekuoti darbo stalus ir užterštas vienkartines priemones šalinti pagal patvirtintą biologinių atliekų tvarkymo tvarką.

Keturios taisyklės pamokoje padeda suvaldyti didžiąją rizikos dalį. Vienas tamponėlis ir vienas stiklelis skirti vienam mėginio davėjui; jais niekada nesidalijama. Mėginį galima imti tik iš savęs, niekada iš kaimyno. Vienkartiniai tamponėliai ir dantų krapštukai iš karto keliauja į tam skirtą atliekų talpyklą, o ne atgal ant darbo stalo. Pats metileno mėlynasis dažo odą ir drabužius bei dirgina akis, todėl būtinos pirštinės ir įprastos higienos priemonės dirbant su dažikliais. Neplėskite šios užduoties augindami bet ką iš tepinėlio ir neimprovizuokite fiksuodami šviežią žmogaus kilmės medžiagą kaitinimu, jei to nenumato mokyklos saugos tvarka.

Ką stebėti ir kodėl vaizdas toks

Didindami 100x, ieškokite plačių, plokščių, blyškiai mėlynų ląstelių netaisyklingais ovaliais arba daugiakampiais kontūrais. Jos išsidėsčiusios pavieniui arba laisvais persidengiančiais sluoksniais. Kiekvienoje ląstelėje paprastai matoma viena tamsesnė mėlyna dėmė. Tai branduolys. Atkreipkite dėmesį ir į išsidėstymą: plokščiojo epitelio ląstelės yra plonos plokštelės, o ne rutuliai, todėl jų kraštai primena sutrūkinėjusią glazūrą, o ne apvalius balionus.

Didinant 400x, aiškiai išryškėja trys požymiai. Ląstelės riba atrodo kaip ją apjuosianti plona tamsesnė linija. Citoplazma užpildo vidų šviesia, tolygia mėlyna spalva. Branduolys yra tamsesnis ir kompaktiškesnis, dažnai ovalus, paprastai arti centro, bet ne visada. Paprašykite mokinių užfiksuoti visus tris požymius, taip pat formą ir didinimą, nes būtent to prašoma užduočių lape.

Čia svarbus vienas tikslumo aspektas, kuris daugelyje užduočių lapų pateikiamas klaidingai. Matoma riba atitinka plazminės membranos sritį, tačiau pati membrana – maždaug 7 iki 10 nanometrų storio lipidų dvisluoksnis – yra gerokai mažesnė už mokyklinio mikroskopo skiriamąją gebą. Mokiniai mato optinį ląstelės kraštą ir ten susikaupusį dažiklį. Ta pati išlyga taikoma organelėms. Šiame preparate nematyti mitochondrijų, endoplazminio tinklo, Goldžio aparato ir ribosomų. Įprastas šviesinis mikroskopas geromis sąlygomis leidžia atskirti maždaug 0.2 mikrometro dydžio detales, kaip paaiškinama NCBI ląstelių biologijos apžvalgoje apie mikroskopijos priemones, o dauguma ultrastruktūros elementų yra mažesni už šią ribą arba jai artimi. Didesnis tuščiasis didinimas tik padidina vaizdą, bet neprideda detalių.

Kodėl branduolys nusidažo tamsiausiai? Metileno mėlynasis yra katijoninis dažiklis, tirpale turintis teigiamą krūvį, todėl jis jungiasi su neigiamai įkrautomis ląstelės medžiagomis, pirmiausia nukleorūgštimis. Chromatine DNR sutelkta branduolyje, todėl branduolyje susikaupia daugiausia dažiklio. Citoplazmoje yra RNR ir kitų įkrautų molekulių, todėl ji taip pat nusidažo, bet ne taip sutelktai ir šviesiau. Svarbiausia išlyga: metileno mėlynasis nėra DNR specifinis dažiklis. Tyrime apie metileno mėlynojo pasiskirstymą vaizdinant branduolius aprašomas katijono jungimasis su sritimis, kuriose gausu nukleorūgščių, o ankstesniame kiekybiniame tyrime apie metileno mėlynojo prisijungimą ląstelių preparatuose nustatyta, kad didžioji prisijungusio dažiklio dalis buvo susijusi su nukleorūgštimis. Taigi tamsus branduolys ir šviesi citoplazma yra kontrasto vaizdas, o ne molekulinis tyrimas.

Mokinių klaidos ir kaip jas atpažinti

Beveik kiekvieną nepavykusį preparatą galima priskirti vienam iš penkių tipinių atvejų. Mokykite mokinius nustatyti preparato problemą, o ne aklai kartoti darbą.

Per stipriai nudažius, ląstelės ir fonas tampa vienodai tamsūs, todėl branduolys susilieja su regėjimo lauku. Tai ištaisoma trumpinant dažymo laiką arba kruopščiau nuskalaujant. Per silpnai nudažius lieka blyškūs šešėliai, kurie pranyksta padidinus apšvietimą; ilginkite dažymo laiką po trisdešimt sekundžių. Stori tepinėliai sudaro tankias persidengiančias mases, kuriose neįmanoma atsekti jokio kontūro; taisyti reikia patį mėginio paskleidimą – kitą kartą paskleisti ploniau, nes joks skalavimas neišgelbės ląstelių krūvos. Oro burbuliukai atrodo kaip taisyklingi apskritimai ryškiais tamsiais kraštais ir klaidina pradedančiuosius, kurie palaiko juos struktūromis; dengiamąjį stiklelį uždėkite iš naujo, lėtai leisdami jį kampu. Maži tamsūs taškeliai ant ląstelių ar aplink jas paprastai yra įprastos burnos bakterijos, kaip pažymima mokykliniuose protokoluose, pavyzdžiui, „Ingrid Science“ skruosto ląstelių tyrimo apraše. Jie patvirtina, kad burnoje gyvena mikroorganizmai, ir tai mokiniams gali įstrigti, tačiau atliekant šią užduotį neįmanoma nustatyti jų rūšies, todėl jų nereikėtų piešti kaip ląstelės dalių. Maisto liekanos ir gleivių gijos nusidažo netolygiai ir intensyviai; pradinis burnos skalavimas skirtas jų kiekiui sumažinti.

Ko ši užduotis negali parodyti

Tai mokomasis stebėjimas, o ne diagnostinis tyrimas. Ląstelių išvaizda mokykliniame dažytame preparate negali būti pagrindas diagnozuoti infekciją, vėžį ar bet kokią kitą ligą, ir šio straipsnio nereikėtų suprasti kaip teigiančio priešingai. Preparatas parodo formą, ribą, citoplazmą ir branduolį taikant du didinimus. Jis neparodo membranos ultrastruktūros, organelių detalių ar molekulinės tapatybės. Aiškiai įvardijus šią ribą, apsaugomas ir mokslinis tikslumas, ir mokiniai: geras rezultatas yra teisingai pažymėtas piešinys, kuriame nurodytas didinimas ir dažiklis, o ne išvada apie sveikatą.

Mokinio užduočių lapas ir mikrofotografijos su žymomis

Du šiam puslapiui skirti projekto ištekliai yra pirmiau pateikta mikrofotografija su žymomis ir toliau pateiktas užduočių lapas. Išspausdinkite po vieną užduočių lapą kiekvienam mokiniui arba parodykite jį projektoriumi ir paprašykite mokinių persibraižyti langelius į sąsiuvinius.

Kaip jį naudoti per 45 minučių pamoką: dešimt minučių saugos instruktažui ir mėginių ėmimui, dešimt minučių dažymui ir preparato paruošimui, penkiolika minučių stebėjimui ir piešimui abiem didinimais, dešimt minučių kontroliniam sąrašui ir palyginimui su mikrofotografija su žymomis. Kontrolinio sąrašo punktai sąmoningai konkretūs. Plonas tepinėlis, tinkamas dažymo laikas, branduolys tamsesnis už citoplazmą, užrašytas didinimas. Mokinys, galintis pažymėti visus keturis punktus, suprato pagrindinę pamokos mintį: mikroskopai parodo skirtumus, o dažikliai sukuria skirtumus, kuriuos verta parodyti.