Reaktyviųjų deguonies formų matavimas eksperimentuose su metileno mėlynuoju

Dvi laboratorijos atlieka eksperimentus, kuriuos abi vadina metileno mėlynojo antioksidacinio poveikio tyrimais. Viena praneša, kad dažiklis slopina reaktyviųjų deguonies formų susidarymą. Kita praneša, kad jis jas generuoja. Abi pateikia aiškias dozės ir atsako kreives. Abi sąžiningai aprašo savo rezultatus. Skirtumą lemia ne sukčiavimas ar nekompetencija. Šios dvi grupės matavo skirtingus dalykus skirtingo apšvietimo sąlygomis, naudodamos zondus, atsakančius į skirtingus klausimus, o paskui abu atsakymus apibūdino tuo pačiu terminu: ROS.

Metileno mėlynąjį tiksliai tirti sunku, nes jis dalyvauja cheminėse reakcijose, kurias turėtų padėti stebėti. Tamsoje jis perneša elektronus tarp donorų ir akceptorių ir grįžta į pradinę formą, pasirengęs naujam ciklui. Šviesoje jis tampa fotosensibilizatoriumi ir pereina į sužadintą tripletinę būseną, iš kurios gali perduoti energiją deguoniui ir sudaryti singletinį deguonį arba pernešti elektronus ir sudaryti radikalus bei vandenilio peroksidą. Bet kurį į tokią sistemą įdėtą zondą pats dažiklis gali oksiduoti, redukuoti, išblukinti arba optiškai užmaskuoti. Todėl pirmasis klausimas vertinant bet kokį ROS rodmenį niekada nėra skaitinė jo vertė. Pirmiausia reikia klausti, ką tyrimas iš tikrųjų aptinka ir kaip dažiklis veikia patį tyrimą.

Amplex Red: kalibruotas vandenilio peroksido tyrimas

Tinkamai paruoštas metileno mėlynojo ir Amplex Red derinys yra geriausiai pagrįstas šioje literatūroje. Reakcija yra specifinė: krienų peroksidazė naudoja vandenilio peroksidą Amplex substratui oksiduoti iki fluorescuojančio produkto rezorufino, o stechiometrinis santykis yra maždaug vienas su vienu. Mėginyje esantis peroksidas detektoriuje virsta fluorescencijos signalu. Jokia kita įprastai ROS grupei priskiriama forma šios reakcijos tiesiogiai nesukelia.

Lemiamas pranašumas yra kalibravimas. Kruopštus tyrėjas išmatuoja žinomos koncentracijos peroksido etalonus tame pačiame buferyje, su tomis pačiomis peroksidazės ir substrato koncentracijomis, ta pačia inkubacijos trukme ir tais pačiais optiniais nustatymais, o paskui mėginių rodmenis vertina pagal gautą kreivę. Izoliuotų smegenų mitochondrijų tyrime, kuriuo grindžiamas šis metodas, autoriai darė būtent taip: kiekvieno matavimo pabaigoje pridėjo žinomus peroksido kiekius, o rezultatus pateikė kaip greičius pikomoliais per minutę vienam miligramui baltymo, o ne sutartiniais fluorescencijos vienetais. Būtent tai švytėjimą paverčia matavimu.

Verta perimti tris šio tyrimo detales. Pirma, autoriai patikrino signalą naudodami katalazę, kuri skaido peroksidą. Pridėjus katalazės, metileno mėlynojo sukeltas fluorescencijos didėjimas sustojo, patvirtindamas, kad signalą sukėlė peroksidas, o ne optinis artefaktas. Antra, jie tiesiogiai patikrino apšvietimo poveikį: užraktu ribojo sužadinimo spindulį taip, kad mėginiai gautų vieną aštuntąją įprastos šviesos dozės, o signalas sumažėjo tik devyniais procentais. Daugiau kaip devyniasdešimt procentų jų nustatyto peroksido nepriklausė nuo matavimo šviesos. Trečia, jie atskirai elektrodu matavo peroksido pašalinimą ir nustatė, kad dažiklis ir didino jo gamybą, ir lėtino pašalinimą. Zondas, rodantis tik grynąją fluorescenciją, būtų sujungęs šiuos du poveikius.

Šis tyrimas vis tiek gali duoti klaidingus rezultatus, o metileno mėlynasis sukelia ne vieną tokią problemą. Dažiklis plačiai sugeria šviesą toje pačioje raudonojoje spektro srityje, kurioje šviesą skleidžia rezorufinas, todėl esant didelėms dažiklio koncentracijoms mėginys dėl vidinio filtro efektų gali užmaskuoti savo paties signalą. Dėl to etalonuose turėtų būti tokia pati dažiklio koncentracija kaip ir mėginiuose. Amplex Red taip pat gali pats fotooksiduotis, o jo produktas rezorufinas gali dalyvauti fotoredokso cikluose, kuriuose susidaro superoksidas ir peroksidas. Tai ypač svarbu, kai eksperimento metu kartu apšviečiamas fotosensibilizatorius. Praktinis sprendimas – pirmiausia apšvitinti metileno mėlynojo mėginius, o tada jų alikvotas tirti su Amplex reagentais tamsoje, užuot kartu apšvietus dažiklį ir zondą. Galiausiai superoksido dismutazė ne vien slopina Amplex signalą: superoksido virtimas peroksidu gali jį padidinti. Kontrolinis bandymas su SOD, kuriame fluorescencija padidėja, nėra nepavykęs. Jis parodo, kad superoksidas dalyvauja ankstesniame reakcijų grandinės etape.

DCFDA: nespecifinis oksidacijos indikatorius

Metileno mėlynojo ir DCFDA derinys yra didžiosios dalies painiavos šaltinis. DCFH-DA yra pirmtakas, skirtas zondui į ląsteles įvesti. Ląstelės viduje esterazės pašalina jo acetato grupes ir palieka nefluorescuojantį DCFH, o oksiduojant DCFH susidaro fluorescuojantis DCF. Jį oksiduojančių medžiagų sąrašas ilgas: hidroksilo radikalai, peroksidazės ir hemo tarpiniai junginiai, azoto dioksidas, hipochlorito rūgštis ir iš peroksinitrito susidarę radikalai. Vien vandenilio peroksidas tiesiogiai jo neoksiduoja jokiu praktiškai reikšmingu greičiu; nuo peroksido priklausomai fluorescencijai paprastai reikia geležies, hemo baltymų arba peroksidazės reakcijų.

Kritinis vertinimas, kurį reikėtų cituoti kiekviename metodų skyriuje, pateiktas Kalyanaraman ir kolegų DCFH kaip zondo analizėje, apibendrintoje smegenų mitochondrijų tyrime, kuriame dėl šios priežasties atsisakyta DCFDA. Ši analizė parodė, kad dažiklis reaguoja lėtai, jo reakcijos stechiometrija neapibūdinta, nėra tinkamo kalibravimo, be to, jis reaguoja ir su ROS nepriskiriamais junginiais. Zondas taip pat sustiprina tai, ką matuoja: vieno elektrono oksidacijos metu iš DCFH susidaro DCF radikalas, kuris reaguoja su deguonimi ir sudaro superoksidą, o šis dismutuoja, sudarydamas papildomą peroksidą. Pats matavimas iš dalies sukuria tas chemines reakcijas, apie kurias praneša.

Visa tai nereiškia, kad DCFDA nenaudingas. Tai reiškia, kad jis tinka atrankiniam tyrimui, o ne medžiagoms identifikuoti. DCF fluorescencijos padidėjimas reiškia, kad padidėjo nuo oksidantų priklausoma zondo oksidacija. Tai nereiškia, kad padaugėjo peroksido, ir tikrai nereiškia, kad padidėjo bendras ROS kiekis – jo nematuoja nė vienas atskiras zondas. Ankstesniuose metileno mėlynojo tyrimuose, kuriuose buvo remiamasi DCF oksidacija esant didesnei nei vieno mikromolio litre koncentracijai, nustatytas prooksidacinis poveikis, o kitose to paties laikotarpio sistemose nustatyta apsauga nuo peroksido sukeltos ląstelių žūties. Abu pastebėjimai gali būti teisingi tam pačiam dažikliui skirtingomis redokso sąlygomis, o vien DCF rezultatas negali parodyti, kuris oksidantas sukėlė signalą. Ankstesnio smegenų mitochondrijų tyrimo svarba ta, kad jame šis atrankinis metodas buvo pakeistas kalibruotu peroksido matavimu ir tiesiogiai nustatyta oksidantų apkrova: net šimto nanomolių litre dažiklio koncentracija kelis kartus padidino peroksido išsiskyrimą su kiekvienu tirtu substratu ir visose tirtose kvėpavimo būsenose.

DCFDA turi dar vieną būtent metileno mėlynajam būdingą spąstą. Dažiklis yra intensyvios spalvos ir redokso aktyvus, todėl gali išblukinti fluorescenciją, slopinti šviesos emisiją arba oksiduoti zondą nepriklausomai nuo ląstelinių ROS. Kontrolinis bandymas su dažikliu ir zondu, bet be ląstelių, nėra neprivalomas priedas. Tai eksperimentas, kuris parodo, ar dažiklis sąveikauja su zondu.

Sukinio gaudymas ir deguonies suvartojimas: tapatybė ir srautas

Fluorescenciniai zondai parodo, kad atsirado kažkas, kas gali juos oksiduoti, o elektronų sukinio rezonansas su sukinio gaudyklėmis leidžia tiksliau nustatyti, kas tai buvo. Klasikiniame metileno mėlynojo fotochemijos tyrime ESR naudotas askorbato radikalui aptikti dažiklio, askorbato ir šviesos sistemoje. Vėliau deguonies suvartojimo eksperimentais parodytas peroksido susidarymas, o sukinio gaudymo bandymais – geležies katalizuojamas hidroksilo radikalų susidarymas. Kiekvienas metodas atsakė į klausimą, į kurį kiti atsakyti negalėjo: ESR nustatė radikalo tapatybę, deguonies suvartojimas parodė reakcijos srautą nepriklausomai nuo bet kokio fluorescencinio zondo, o šių metodų derinys atskleidė, kad toje pačioje apšviestoje sistemoje veikė ir singletinio deguonies, ir radikalų susidarymo keliai.

Tas 1984 metų rezultatas iki šiol skamba kaip įspėjimas. Esant apšvietimui ir reduktoriui, dažiklis generavo peroksidą, o esant geležiai sistema gamino hidroksilo radikalą – reaktyviausią iš šių formų. Autoriai tai susiejo su askorbatu akyje ir suabejojo neapdairiu naudojimu oftalmologijoje. Šiuolaikiniai skaitytojai turėtų atkreipti dėmesį į sąlygas: šviesa, reduktorius ir geležis. Pašalinus bent vieną iš jų, šis reakcijų kelias susilpnėja arba išnyksta.

Deguonies elektrodų vertė kitokia. Clark tipo elektrodas matuoja grynąjį deguonies suvartojimą ir taip patvirtina, kad dažiklio skatinamos redokso reakcijos sunaudoja molekulinį deguonį, bei pateikia kinetikos duomenis, kurių negali imituoti joks fluorescencijos artefaktas. Tačiau jis neidentifikuoja produkto. Peroksido, superoksido ir vandens susidarymas bei singletinio deguonies nykimas – visi šie procesai sunaudoja deguonį. Srautas be tapatybės yra toks pat neišsamus kaip tapatybė be srauto, todėl metodologiškai tvirtuose darbuose elektrodas derinamas su kalibruotu peroksido tyrimu arba gaudykle.

Kodėl antioksidacinio poveikio rezultatai prieštarauja vieni kitiems

Palyginus šiuos tris rodmenis, tariami prieštaravimai metileno mėlynojo literatūroje paaiškėja kaip metodų skirtumų ir trijų biologinių faktų pasekmė.

Pirma, dažiklis yra ir elektronų pernešėjas, ir peroksido šaltinis. Nukreipdamas elektronus nuo kvėpavimo grandinės vietų, kuriose deguonis kitaip virstų superoksidu, jis gali sumažinti vienos ROS kiekį, o jo redukuota forma tiesiogiai redukuoja deguonį iki peroksido ir taip padidina kitos ROS kiekį. Todėl laboratorija, tirianti mitochondrijų redokso reakcijas ir dažiklio vaidmenį apeinant elektronų pernašos grandis, turėtų tikėtis nuo zondo priklausomų atsakymų: toje pačioje kiuvetėje superoksidui jautrus rodmuo mažėja, o peroksido rodmuo didėja.

Antra, mažos peroksido dozės yra signalas, o ne vien pažaidos šaltinis. Po ankstesnio darbo atliktame pelių smegenų mitochondrijų tyrime nustatytas peroksido susidarymas jau esant penkiasdešimties nanomolių litre dažiklio koncentracijai, be mitochondrijų DNR pažaidų esant terapinėms koncentracijoms, o po išankstinio poveikio nustatyta apsauga nuo rotenono sukeltų pažaidų. Tik esant šimto mikromolių litre koncentracijai, gerokai viršijančiai terapinį intervalą, dažiklis pažeidė pasirinktus DNR fragmentus, o raudona šviesa kartu su dvidešimties mikromolių litre dažiklio koncentracija sukėlė singletinio deguonies susidarymą, kuris pažeidė visus tirtus fragmentus. Siūlomas mechanizmas yra hormetinis: nedidelė peroksido gamyba suaktyvina su Nrf2 susijusią antioksidacinę apsaugą ir mitochondrijų biogenezę, todėl trumpalaikis prooksidacinis rodmuo atsiranda prieš ilgalaikį antioksidacinį rezultatą. Po vienos valandos ir po vienos dienos nuskaitytų tyrimų rezultatai gali skirtis, nes per tą laiką pasikeitė biologinė būklė.

Trečia, šviesa lemia net tai, kokia molekulė yra sistemoje. Apšvietimas demetilina dažiklį, sudarydamas Azure B ir giminingus produktus, o virš lėkštelės esančios mikroskopo lempos pakanka jo fotosensibilizuojančiam poveikiui suaktyvinti. Eksperimentai tamsoje ir šviesoje yra skirtingi eksperimentai, ir bet kurio protokolo apšvietimo ir darbo su dažikliu kontrolės skyriuje į juos reikėtų taip ir žiūrėti.

Minimalus kontrolinių bandymų rinkinys ir kaip vertinti bet kurį teiginį

Toliau pateiktas palyginimas yra originali šio straipsnio informacinė lentelė. Prieš priimdami bet kokį metileno mėlynojo ROS rezultatą, patikrinkite, kurias eilutes autoriai įgyvendino, o kurias praleido.

Iš to išplaukia praktinė rezultatų vertinimo taisyklė. Kalibruotas Amplex tyrimas su peroksidaze ir patikra katalaze pateikia įrodymų apie peroksidą. DCFDA pateikia įrodymų apie nespecifinę zondo oksidaciją ir nieko daugiau. Sukinio gaudymas su radikalų gaudiklių kontroliniais bandymais pateikia įrodymų apie radikalų tapatybę. Deguonies suvartojimas pateikia įrodymų apie srautą. Sakinys, kuriame teigiama daugiau, nei gali pagrįsti tyrimas, kad ir kaip užtikrintai jis būtų parašytas, yra sakinys apie zondą, o ne apie dažiklį. Susijusios diskusijos apie priklausomybę nuo dozės ir hormetinį intervalą, mitochondrijų elektronų srautą, trukdžius tyrimams dažytuose mėginiuose ir mikroskopijos apšvietimo artefaktus papildo kiekvieną iš šių minčių, o kiekviena jų lieka pagrįsta pakeitus laikinąją nuorodą.