Paprastasis dažymas metileno mėlynuoju ir dažymas Gramo būdu: ką gali įrodyti kiekvienas metodas

Studentas paruošia tepinėlį iš kultūros, pažymėtos E. coli, vienai minutei užlieja jį metileno mėlynuoju, nuplauna ir apžiūri pro aliejinės imersijos objektyvą. Regėjimo lauką užpildo mėlynos lazdelės. Laboratorinio darbo ataskaitoje rašoma: „Gramneigiamos lazdelės, identifikuotos kaip E. coli.“ Stebėjimas teisingas. Tačiau šis preparatas tokios išvados nepagrindžia.

Klaida yra ne techninė, o konceptuali. Studentas paprastąjį dažymą vertino taip, lyg tai būtų diferencinis tyrimas. Paprastasis dažymas ir dažymas Gramo būdu atsako į skirtingus klausimus, nes grindžiami skirtingais dažymo principais. Vienas klausia: kokia yra ląstelių forma. Kitas klausia: kaip ląstelės sienelė elgiasi veikiama reagentų. Supainiojus šiuos metodus, net tinkamai nudažytas preparatas tampa nepagrįstos ataskaitos pagrindu.

Šiame palyginime abu metodai aiškiai atskiriami, parodoma, kokius teiginius leidžia pagrįsti kiekvieno metodo rezultatas, ir atsakoma į du dažniausius studentų klausimus: ar metileno mėlynąjį galima naudoti dažant Gramo būdu ir ką iš tiesų parodo E. coli dažymas metileno mėlynuoju.

Trumpas atsakymas

Paprastai dažant metileno mėlynuoju, visos nusidažančios ląstelės įgauna tą pačią mėlyną spalvą, todėl matoma morfologija (lazdelės, rutuliai, spiralės) ir išsidėstymas (pavieniui, poromis, grandinėlėmis), tačiau nieko nesužinoma apie priklausymą Gramo grupei. Dažant Gramo būdu papildomai naudojamas jodas, nublukinimo etapas ir kontrastinis dažiklis, todėl bakterijos suskirstomos į gramteigiamas (violetines) ir gramneigiamas (rausvas arba raudonas) pagal tai, kaip jų apvalkalai išlaiko dažiklį. Mėlynos lazdelės po dažymo metileno mėlynuoju reiškia „yra lazdelės formos ląstelių“. Rausvos lazdelės po visos Gramo dažymo sekos reiškia „yra gramneigiamų lazdelių“. Antrasis teiginys tvirčiau pagrįstas, nes procedūra apėmė papildomą tyrimą.

Apie platesnę bakterijų dažymo vienu dažikliu metodų grupę, kuriai priklauso šiame straipsnyje aptariamas metodas, skaitykite mikroskopinio dažymo atlase.

Paprastasis dažymas: vienas dažiklis, vienas klausimas

Metileno mėlynasis yra bazinis (katijoninis) dažiklis. Jo spalvotasis jonas turi teigiamą krūvį ir jungiasi prie neigiamą krūvį turinčių ląstelės struktūrų, įskaitant nukleorūgštis ir rūgštines paviršiaus grupes, todėl šviesiame fone ląstelės atrodo mėlynos. „OpenStax“ šį pozityviojo dažymo principą aprašo dažymui skirtame skyriuje. Pats dažiklio katijonas yra nedidelis plokščias fenotiazino jonas, išsamiai aprašytas metileno mėlynojo chemijos žinyne; chlorido priešjonis spalvos nesuteikia.

Standartinis mokomasis protokolas sąmoningai paprastas: paruošti ploną tepinėlį, išdžiovinti ore, fiksuoti karščiu, maždaug vienai minutei užlieti maždaug 1% vandeniniu metileno mėlynojo tirpalu, švelniai nuplauti vandeniu, nusausinti sugėrimo būdu ir tirti naudojant aliejinę imersiją. „LibreTexts“ mokomajame protokole nurodomas būtent toks 1% tirpalo ir vienos minutės variantas, kartu pažymint, kad kai kuriose laboratorijose dažoma ilgiau. Nėra kandiko, nublukinimo reagento ar antro dažiklio. Būtent tai ir svarbu. Kai naudojamas tik vienas dažiklis ir jis nėra selektyviai pašalinamas, visos jį surišančios ląstelės galiausiai būna vienodos spalvos.

Dažant E. coli, tikimasi matyti mėlynas lazdeles (bacilas), pavienes, poromis arba nedidelėmis grupėmis. Mėlyną spalvą suteikia dažiklis. Lazdelės forma būdinga organizmui. Tačiau šis derinys organizmo neidentifikuoja, nes daugelio rūšių bakterijos yra lazdelės ir daugelis jų paprastai dažant nusidažo mėlynai. ATCC mikrobiologinių kultūrų vadove aiškiai nurodo šią ribą: nustatoma tik morfologija. Teisinga ataskaitos formuluotė: „stebėtos mėlynos bacilos“. Bet kokiam teiginiui, peržengiančiam formos ir išsidėstymo ribas, reikia daugiau įrodymų.

Dažymas Gramo būdu: keturi reagentai, vienas elgsenos tyrimas

Dažymas Gramo būdu yra diferencinis dažymas. Visos ląstelės veikiamos ta pačia reagentų seka ir stebima, kurios išlaiko pirmąjį dažiklį, o kurios jį praranda. Amerikos mikrobiologijos draugijos Gramo dažymo protokoluose apibrėžta standartinė keturių etapų seka: kristalvioletas (pirminis dažiklis), Gramo jodas (kandikas), alkoholis arba acetono ir alkoholio mišinys (nublukinimo reagentas), tada safraninas (kontrastinis dažiklis).

Standartinis mokomasis modelis šį skirtumą aiškina apvalkalo sandara. Gramteigiamos ląstelės turi storą peptidoglikano sienelę, kuri plaunant alkoholiu dehidratuoja ir išlaiko kristalvioleto bei jodo kompleksą. Gramneigiamos ląstelės turi ploną peptidoglikano sluoksnį ir lipidų gausią išorinę membraną, kurią pažeidžia nublukinimo reagentas, todėl kompleksas išplaunamas, o ląstelės vėliau nusidažo safraninu. „NCBI Bookshelf“ Gramo dažymo apžvalgoje pateikiamas šis ląstelės sienele grindžiamas paaiškinimas. Specialistai priduria, kad visas fizikocheminis procesas sudėtingesnis ir priklauso ne vien nuo sienelės storio, tačiau interpretuojant laboratorinį rezultatą elgsenos taisyklė galioja: violetinė spalva reiškia, kad dažiklis išlaikytas, rausva – kad jis prarastas ir ląstelė nudažyta kontrastiniu dažikliu.

Iliustraciniai vaizdai. Stilizuoti piešiniai metodams palyginti, ne fotoaparatu užfiksuotos mikrofotografijos. Spalvos supaprastintos, kad būtų aiški metodo logika: viena spalva paprastai dažant, dvi spalvos po nublukinimo Gramo metodu.

Ar metileno mėlynąjį galima naudoti dažant Gramo būdu

Šį klausimą galima suprasti dvejopai, ir kiekvienu atveju atsakymas skiriasi.

Pirmoji reikšmė: ar vienkartinis užliejimas metileno mėlynuoju gali pakeisti visą Gramo dažymo seką. Ne. Be jodo, nublukinimo reagento ir kontrastinio dažiklio nėra diferencinio etapo, todėl priklausymas Gramo grupei netiriamas. Mėlynas laukas panaudojus vien metileno mėlynąjį yra paprastojo dažymo rezultatas, net jei buteliukas stovi šalia Gramo dažymo reagentų. Neregistruokite jo kaip Gramo dažymo rezultato.

Antroji reikšmė: ar metileno mėlynasis gali pakeisti safraniną kaip kontrastinis dažiklis 4 etape. Funkciškai jis gali nudažyti nublukintas ląsteles, o vadovėlinėje užduotyje po tokio pakeitimo būtų tikimasi violetinių gramteigiamų ir mėlynų gramneigiamų ląstelių. Logika pagrįsta, nes tinkamai nublukintos gramneigiamos ląstelės yra beveik bespalvės ir gali surišti kitą katijoninį dažiklį. Tačiau tai nėra standartinis protokolas. ASM protokoluose nurodomas safraninas, o kai kuriuose variantuose pripažįstamos alternatyvos, pavyzdžiui, bazinis fuksinas, bet ne metileno mėlynasis. Yra ir praktinis trūkumas: mėlyną spalvą nuo violetinės atskirti sunkiau nei rausvą nuo violetinės, ypač pradedantiesiems ir ypač naudojant susidėvėjusias mikroskopo lempas. Atlikdami mokomuosius darbus ir visais atvejais, kai rezultatas svarbus, naudokite protokole nurodytą kontrastinį dažiklį, paprastai safraniną, o kontrastinį dažymą metileno mėlynuoju vertinkite kaip demonstracinį variantą, ne kaip lygiavertį standartą.

Susijęs klausimas, kaip metileno mėlynasis skiriasi nuo kitų dažymo vienu dažikliu galimybių, aptariamas paprastųjų bakterijų dažymo metodų palyginime.

Ką įrodo E. coli dažymas metileno mėlynuoju ir ko neįrodo

E. coli yra gramneigiama lazdelė, tačiau šis sakinys sujungia keliais metodais nustatytus faktus: morfologiją iš mikroskopijos, Gramo reakciją iš dažymo Gramo būdu ir tapatybę iš kultūros tyrimo bei biocheminių ar molekulinių tyrimų. Metileno mėlynuoju nudažytas tepinėlis suteikia tik pirmąją dalį. Jis parodo, kad nudažytame mėginyje yra lazdelės formos ląstelių ir kaip jos išsidėsčiusios. Jis nenustato Gramo reakcijos, nes nebuvo atliktas nublukinimo etapas. Jis neidentifikuoja rūšies, nes esant tokiai skiriamajai gebai daugelio rūšių lazdelės atrodo panašiai.

Būtent čia ataskaitose pasikartoja nuspėjama klaida. Autorius į stebėjimo aprašymą perkelia išankstines žinias („ši kultūra turėtų būti E. coli, o E. coli yra gramneigiama“), todėl atrodo, kad preparatas patvirtina tai, kas iš tiesų buvo tik numanyta. Tikslesnėje ataskaitoje šie lygmenys atskiriami: „Paprastasis dažymas metileno mėlynuoju: stebėtos mėlynos bacilos; nustatyta tik morfologija, priklausymas Gramo grupei netirtas.“ Tada, jei dažymas Gramo būdu atliktas tinkamai ir naudoti kontroliniai mėginiai: „Dažymas Gramo būdu: rausvos lazdelės, atitinkančios gramneigiamų bakterijų požymius.“ Rūšis nustatoma vėliau, taikant identifikavimo procedūras, o ne vien pagal spalvą.

Praktinis interpretavimo vadovas

Dirbdami laboratorijoje vadovaukitės šia sprendimo taisykle. Jei visos ląstelės vienos spalvos, o pagal protokolą naudotas vienas dažiklis be nublukinimo reagento, atlikote paprastąjį dažymą. Aprašykite formą, apytikslį dydį ir išsidėstymą. Tuo ir apsiribokite. Jei pagal protokolą naudoti kristalvioletas, jodas, nublukinimo reagentas ir kontrastinis dažiklis kartu su žinomais teigiamais ir neigiamais kontroliniais mėginiais, atlikote dažymą Gramo būdu. Aprašykite spalvą ir morfologiją: violetiniai kokai grandinėlėmis, rausvos lazdelės ir panašiai.

Didžiąją dalį painiavos sukelia trys klaidos. Pirma – mėlynų lazdelių laikymas E. coli patvirtinimu. Antra – metileno mėlynuoju nudažyto preparato registravimas užrašų skiltyje „Dažymas Gramo būdu“, o tai vėlesni skaitytojai interpretuos klaidingai. Trečia – neapgalvotas kontrastinių dažiklių keitimas ir vėlesnis spalvų lyginimas tarp laboratorijų taip, lyg naudotos spalvų paletės sutaptų. Visos klaidos taisomos vienodai: įvardykite iš tiesų atliktą metodą ir teikite tik tokius teiginius, kuriuos tas metodas leidžia patikrinti.

Paprastasis dažymas vertingas būtent todėl, kad leidžia teigti nedaug. Jis greitas, atlaidus nedideliems procedūros netikslumams ir pakankamas, kai klausimas susijęs su morfologija: ar kas nors yra ir kokios tai formos. Kai reikia klasifikuoti, atlikite diferencinį tyrimą. Mėlynai nudažytas preparatas parodo, kaip ląstelės atrodo. Violetinis arba rausvas preparatas parodo, kaip elgiasi jų sienelės. Nė vienas preparatas atskirai rūšies nenustato.