Naujasis metileno mėlis ir retikulocitų dažymas: atskiras dažiklis ir gyvų ląstelių metodas

Studentas ruošiasi skaičiuoti retikulocitus, užsisako metileno mėlio, sumaišo jį su krauju ir beveik nieko nemato. Bendrakursis naudoja buteliuką, pažymėtą „naujasis metileno mėlis“, ir dalyje eritrocitų mato aiškius mėlynus siūlelius. Pirmasis studentas mano, kad antrajame buteliuke esantis dažiklis yra šviežesnis arba labiau koncentruotas. Nei viena, nei kita. Jame yra kitokia molekulė.

Būtent ši sąvokų painiava lemia daugumą nesusipratimų šioje srityje. Pavadinimas leidžia manyti, kad naujasis metileno mėlis yra patobulinta metileno mėlio partija. Chemija rodo ką kita. Naujasis metileno mėlis N yra atskiras fenotiazino dažiklis, turintis savo Colour Index numerį, savitą pakaitų išsidėstymą ir standartizuotą paskirtį hematologijoje. Supratus šį skirtumą, likusi metodo dalis (kodėl dažymo metu ląstelės turi būti gyvos, kas laikoma retikulocitu, kokia Heinzo kūnelių reikšmė ir kada naudojamas briliantinis krezilo mėlis) tampa aiški.

Trumpas atsakymas

Naujasis metileno mėlis N, hematologinis reagentas, paprastai identifikuojamas kaip Basic Blue 24 naujojo metileno mėlio PubChem įraše, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, formulė C18H22ClN3S. Įprastas metileno mėlis yra metiltioninio chloridas, Basic Blue 9, jo PubChem įraše, C.I. 52015, CAS 61-73-4, formulė C16H18ClN3S. Struktūriškai naujasis metileno mėlis turi dvi metilo grupes žiede ir etilamino šonines grupes ten, kur metileno mėlis turi dimetilamino grupes. Šis skirtumas keičia dažymo savybes. Hematologijos literatūroje įprastas metileno mėlis apibūdinamas kaip gana prastas retikulocitų dažiklis, o naujasis metileno mėlis – kaip dažantis intensyviau ir tolygiau; šis palyginimas apibendrintas ScienceDirect temoje apie naująjį metileno mėlį.

Taip, naujasis metileno mėlis yra supravitalinis dažiklis. Supravitalinis dažymas reiškia gyvų ląstelių dažymą jas paėmus iš organizmo ir prieš fiksavimą, kaip apibrėžta NCBI supravitalinio dažymo principų apžvalgoje. Tiek naujasis metileno mėlis, tiek briliantinis krezilo mėlis priklauso šiai kategorijai, o CLSI retikulocitų standartas aiškiai apima naująjį metileno mėlį kaip supravitalinį dažiklį. Studentai kartais priskiria šį metodą fiksuotų tepinėlių dažymui Romanovskio būdu. Toks supratimas čia netinka. Pirmiausia užfiksavus ląsteles, metodas nebeveikia.

Skaitytojams, besiaiškinantiems panašius dažiklių pavadinimus, straipsnis metilo mėlis ir metileno mėlis aptaria kitą, dar didesnę painiavą tarp anijoninio triarilmetano dažiklio ir katijoninių fenotiazino dažiklių grupės. Laboratorinio dažymo apžvalgoje supravitaliniai metodai pristatomi greta fiksuotų tepinėlių metodų, o kraujo ląstelių morfologijos vadove parodoma, kokią vietą retikulocitų vertinimas užima platesniame diferenciniame vertinime.

Viena pastaba dėl katalogų: yra atskira naujojo metileno mėlio dvigubosios druskos su cinko chloridu forma, kurios CAS yra 6586-05-6. Todėl metodų skyriuje reikėtų nurodyti druskos formą ir tiekėją, o ne vien bendrinį pavadinimą.

Ką iš tiesų daro supravitalinis dažymas

Retikulocitas yra jaunas eritrocitas, kuris jau neteko branduolio, bet dar turi likutinės ribosominės RNR. Nedažytame šlapiame preparate ši RNR nematoma. Supravitalinis dažiklis patenka į gyvą ląstelę ir nusodina arba sujungia šią RNR į mėlynas granules ir siūlelius – tinklišką siūlinę medžiagą, matomą naudojant aliejinę imersiją. Taigi tinklas yra dažymo produktas, o ne iš anksto susiformavęs karkasas, laukiantis spalvos. Todėl protokolo kintamieji (dažiklio koncentracija, buferis, kraujo ir dažiklio santykis, temperatūra, laikas) yra tokie pat svarbūs kaip dažiklio pavadinimas.

Praktinė išvada – būtina griežta veiksmų seka: pirmiausia sumaišyti kraują su antikoaguliantu ir dažiklį, inkubuoti, tada paruošti tepinėlius ir juos tirti nefiksuotus, be kontrastinio dažymo. Fiksavimas prieš dažymą arba kontrastinis dažymas, užgožiantis neryškius siūlelius, sunaikina informaciją, kuria grindžiamas skaičiavimas.

Praktinis retikulocitų dažymo naujuoju metileno mėliu protokolas

Vienos universalios sudėties nėra, todėl nurodykite, kurią naudojote. Trys aprašyti variantai parodo galimą įvairovę.

Klasikinėje Brecher tipo procedūroje naudojamas maždaug 0.5 procento naujojo metileno mėlio tirpalas su kalio oksalatu. Jis lygiomis tūrio dalimis sumaišomas su gerai išmaišytu krauju su EDTA ir inkubuojamas maždaug 10–15 minučių kambario temperatūroje. Švelniai pakartotinai išmaišius, paruošiami ploni pleištiniai tepinėliai, išdžiovinami ore ir tiriami nefiksuoti, naudojant 100x aliejinės imersijos objektyvą. NCBI retikulocitų skaičiavimo procedūroje aprašyta ši darbo eiga ir jai taikomas skaičiavimo rėmelis.

Dacie ir Lewis variante naudojamas 1.0 procento naujojo metileno mėlio tirpalas citratiniame fiziologiniame tirpale, sumaišomas su 2–4 tūrio dalimis kraujo ir prieš ruošiant tepinėlius laikomas 37 C temperatūroje 15–20 minučių. Neseniai įgyvendinant CLSI H44 procedūros suderinimą naudotas mažesnės koncentracijos, 0.1 procento, tirpalas fosfatiniame buferiniame fiziologiniame tirpale, kurio pH 7.4, inkubuojant 20 C temperatūroje 10 minučių ir nefiksuojant, kaip nurodyta 2026 m. NMB suderinimo tyrime.

Visiems variantams taikomos tos pačios skaičiavimo taisyklės. Ląstelę laikykite retikulocitu, kai joje yra bent dvi atskiros mėlynai nusidažiusios granulės arba siūlelių atkarpos; taip atmetamos pavienės dažiklio nuosėdos. Įprastame darbe suskaičiuokite bent 1,000 eritrocitų ir pateikite retikulocitų dalį procentais. Kai jų procentinė dalis maža, statistikai reikia daugiau ląstelių. CLSI H44 metodikos apžvalgoje pažymima, kad esant maždaug 1 procentui retikulocitų reikia apie 4,400 ląstelių, kad skaičiavimo variacija sumažėtų iki 5 procentų; tai aptariama De Gruyter CLSI H44 apžvalgoje. Miller okuliaro diskas palengvina didelio ląstelių skaičiaus skaičiavimą. Dažiklį filtruokite arba ruoškite šviežią, nes nuosėdos primena granuliuotus intarpus.

Heinzo kūneliai tame pačiame preparate

Tame pačiame supravitališkai dažytame tepinėlyje galima matyti ir Heinzo kūnelius – oksiduoto ir denatūruoto hemoglobino sankaupas, o ne likutinę RNR. Naujuoju metileno mėliu dažytuose preparatuose jie atrodo kaip apvalūs kūneliai, dažnai pavieniai ir šalia membranos, nusidažę šviesesne mėlyna spalva nei tinkliška siūlinė medžiaga. Po fiksavimo ir kontrastinio dažymo jie prastai išlieka, todėl tirkite nefiksuotą tepinėlį. Neseniai taikytame protokole, kuriame naudota 20 mikrolitrų kraujo su EDTA ir 20 mikrolitrų 1 procento naujojo metileno mėlio tirpalo bei 15 minučių inkubacija, ląstelės su Heinzo kūneliais skaičiuotos tarp 250 eritrocitų; tai aprašyta PMC tyrime, kuriame pateikta ši procedūra.

Du skirtumai padeda išvengti klaidingo vertinimo. Pirma, metilvioletas ir kristalvioletas Heinzo kūnelius dažo intensyviau nei naujasis metileno mėlis, kaip pažymėta ScienceDirect temoje apie Heinzo kūnelius. Naujasis metileno mėlis yra patogus pasirinkimas, kai retikulocitai ir Heinzo kūneliai vertinami kartu, bet jis nėra intensyviausiai dažantis specialus Heinzo kūnelių dažiklis. Antra, alfa talasemijos nešiotojų HbH intarpai po supravitalinio dažymo sudaro daug smulkių taškelių visoje ląstelėje, o klasikinių Heinzo kūnelių būna mažiau, jie didesni ir dažnai susiję su membrana. Trečias panašus radinys yra dažiklio nuosėdos: jos yra ne ląstelių židinio plokštumoje ir skirtinguose regėjimo laukuose skiriasi.

Briliantinis krezilo mėlis ir naujasis metileno mėlis

Abu dažikliai naudojami supravitaliniam retikulocitų dažymui, tačiau standartizavimo požiūriu pirmenybė teikiama vienam iš jų. CLSI H44-A2 retikulocitų metodas, sukurtas kartu su Tarptautine hematologijos standartizavimo taryba ir nurodytas CLSI H44 standarto puslapyje, kraujo su EDTA dažymą naujuoju metileno mėliu įvardija kaip rankinį palyginamąjį metodą. Klasikinėje hematologijos mokomojoje literatūroje taip pat sutariama dėl vaizdo: naujasis metileno mėlis siūlelius dažo intensyviau ir tolygiau, o briliantinio krezilo mėlio dažymo rezultatai labiau skiriasi tarp partijų ir mėginių.

Šį statusą reikia patikslinti. ICSH analizatorių vertinimo gairėse rankinis mikroskopinis tyrimas naudojant naująjį metileno mėlį pripažįstamas etaloniniu palyginimo būdu, tačiau vadinamas subjektyviu ir palyginti netiksliu; jei įmanoma, pirmenybė teikiama etaloninėms srauto citometrijos procedūroms. 2022 m. palyginus 100 mėginių nustatyta, kad briliantinis krezilo mėlis turėjo mažesnį poslinkį analizatoriaus rezultatų atžvilgiu nei naujasis metileno mėlis; tai pateikta PMC dažymo metodų palyginime. Pagrįsta santrauka studentams: naudokite naująjį metileno mėlį kaip standartizuotą rankinį palyginimo metodą, bet kurį vietinį briliantinio krezilo mėlio metodą patikrinkite lygindami su juo arba su automatizuotu metodu ir bet kuriuo atveju tikėkitės didesnės rankinės mikroskopijos rezultatų sklaidos. Ankstesnėje standartizavimo literatūroje taip pat siūlyta naudoti išgrynintą Azure B kaip chemiškai grynesnę alternatyvą, nes komercinių dažiklių partijos skyrėsi; tai aptarta Marshall tyrime apie Azure B, paaiškinančiame, kodėl reagentų grynumo klasė vis dar minima aptariant metodus.

Kaip išvengti įprastų klaidų

Keturios klaidos lemia daugumą nesėkmingų preparatų. Užsisakius įprastą metileno mėlį vietoj naujojo metileno mėlio N, dažymas būna silpnas dėl cheminės sudėties, o ne dėl technikos. Fiksavimas arba kontrastinis dažymas prieš vertinimą pašalina supravitalinio dažymo signalą. Skaičiuojant dažiklio nuosėdas kaip granules, rezultatas padidėja; to padeda išvengti dviejų granulių taisyklė ir filtruotas dažiklis. Kai retikulocitų procentinė dalis maža, suskaičiavus per mažai ląstelių gaunamas tiksliai atrodantis skaičius su plačiomis pasikliautinumo ribomis. Visos šios klaidos turi tą patį požymį: mikroskopuotojas kaltina mikroskopą dėl to, ką nulėmė reagentų naudojimo etapas.