Metileno mėlynojo poveikio mitochondrijoms matavimas: deguonis, ATP ir membranos potencialas

Tarkime, laboratorijoje į mitochondrijas, kurių kvėpavimas sutrikęs, pridedama metileno mėlynojo ir stebimas didėjantis deguonies suvartojimas. Natūraliai norėtųsi parašyti, kad dažiklis atkūrė mitochondrijų funkciją. Toks teiginys gali būti klaidingas. Deguonies srautas, ATP sintezė ir membranos potencialas yra trys skirtingos sąvokos. Jos susijusios su ta pačia organele panašiai, kaip atsarginės kopijos, sinchronizavimas ir bendrinimas susiję su tuo pačiu debesijos aplanku: ryšys yra, tačiau veikimo taisyklės skiriasi. Supainiojus vieną su kita, interpretacija tampa klaidinga, net jei kiekvienas matavimas techniškai teisingas.

Metileno mėlynasis didina tokios painiavos tikimybę, nes pats dalyvauja sistemos, kurios veikimas matuojamas, procesuose. Tai redokso cikle dalyvaujantis junginys, priimantis elektronus ankstesnėje grandinės dalyje ir perduodantis juos vėlesnėje, lipofilinis katijonas, besikaupiantis energizuotose mitochondrijose, ir intensyviai mėlynas junginys, sugeriantis bei skleidžiantis šviesą tuose pačiuose spektriniuose ruožuose kaip įprasti zondai. Vieno rodmens tam nepakanka. Budapešto mitochondrijų tyrimuose taikytas patikimas principas – matuoti deguonies srautą, ATP sintezės greitį, membranos potencialą ir vandenilio peroksido išsiskyrimą, kiekviename etape atliekant dažikliui pritaikytus kontrolinius bandymus.

Respirometrija matuoja deguonies srautą, o ne energijos gamybą

Didelės skiriamosios gebos respirometrija, atliekama „Oroboros Oxygraph“ ar „Seahorse“ ekstraląstelinio srauto analizatoriumi, parodo vieną dalyką: kaip greitai redukuojamas deguonis. Ji neparodo, kiek protonų buvo perpumpuota vienam elektronui, kokia gradiento dalis išsaugota ar ar ATP sintazė jį panaudojo.

Terminija svarbi. Izoliuotose mitochondrijose substratas be ADP leidžia nustatyti kvėpavimą dėl protonų nuotėkio, substratas su prisotinančia ADP koncentracija – oksidacinio fosforilinimo pajėgumą, o titravimas atskyrikliu – didžiausią elektronų pernašos pajėgumą. Nepažeistose ląstelėse atitinkami „Seahorse“ rodikliai yra bazinis kvėpavimas, oligomicinui jautrus su ATP gamyba susijęs kvėpavimas, protonų nuotėkis, FCCP nustatomas maksimalus kvėpavimas ir rotenonui bei antimicinui atsparus nemitochondrinis deguonies suvartojimas. „Seahorse“ rodiklius vadinant 3 būsena ir 4 būsena, jiems priskiriamas tikslumas, kurio toks preparatas nepagrindžia, kaip aiškiai nurodyta „Agilent Mito Stress Test“ metodinėje sistemoje.

Metileno mėlynasis suardo intuityvų ryšį tarp didesnio deguonies suvartojimo ir didesnės energijos gamybos. Izoliuotose jūrų kiaulyčių smegenų mitochondrijose nuo 100 nM iki 1 uM dažiklio padidino deguonies suvartojimą ramybės būsenoje, naudojant glutamatą su malatu, sukcinatą ir alfa-glicerofosfatą kaip substratus; su alfa-glicerofosfatu padidėjimas siekė maždaug 64 procentus. Tačiau ADP skatinamas kvėpavimas sveikose mitochondrijose iš esmės nepakito, kaip nurodyta izoliuotų smegenų mitochondrijų tyrime. Kadangi kvėpavimas dėl nuotėkio padidėjo, o ADP skatinamas srautas liko nepakitęs, apskaičiuotas kvėpavimo kontrolės santykis sumažėja. Šis sumažėjimas nereiškia, kad dažiklis pažeidė mitochondrijas. Jis reiškia, kad greta įprasto kvėpavimo dažiklis sukūrė papildomą deguonį vartojantį redokso ciklą. Metileno mėlynojo poveikio deguonies suvartojimui tyrimas, kuriame nurodomas tik padidėjimas, užfiksuoja tikrą cheminį procesą, tačiau nieko nepasako apie energijos išsaugojimą.

Funkcijos atkūrimo eksperimentai rodo tą patį neatitikimą didesniu mastu. Užblokavus I kompleksą, deguonies srautas padidėjo maždaug tris kartus, o ATP sintezė – tik apie 1.5 karto. Elektrodą pasiekė daugiau deguonies. Mažesnė jo dalis buvo panaudota ATP gamybai. Bet kokiam teiginiui apie pagerėjusį oksidacinį fosforilinimą reikia ir ATP duomenų; geriausia juos išreikšti ATP ir deguonies santykiu, nurodant, kaip apibrėžtas vardiklis.

ATP tyrimai matuoja sintezės greitį, kurio negali pakeisti ATP kiekis

ATP tyrimas atsako į kitą klausimą: kiek ATP pagaminama per laiko vienetą. Kinetinis rodmuo, gaunamas kelias minutes stebint jonvabalio luciferazės liuminescenciją arba atliekant susietą heksokinazės ir gliukozės-6-fosfato dehidrogenazės tyrimą su matavimu ties 340 nm, leidžia nustatyti greitį. Vienkartinis galutinio taško bendro ATP matavimas parodo kiekį, atspindintį sintezės ir suvartojimo skirtumą, ir pats savaime mažai ką pasako apie oksidacinį fosforilinimą.

Budapešto grupė naudojo susietą fermentinį metodą, slopindama adenilatkinazę, ir nustatė, kad 1–2 uM metileno mėlynojo nežymiai, bet reikšmingai padidino ATP gamybą rotenonu ir antimicinu paveiktose mitochondrijose. Tai tikras, tačiau dalinis funkcijos atkūrimas. TEGDMA toksiškumo tyrime kitame modelyje gautas panašus rezultatas: 5 mM odontologinio monomero TEGDMA sumažino su I kompleksu susijusį kvėpavimą nuo maždaug 286 iki 28 srauto vienetų, o 2 uM dažiklio jį padidino iki maždaug 86.

Tiriant spalvotą redokso junginį, būtini du kontroliniai bandymai. Pirma, naudokite oligomiciną, kad nustatytumėte, kokia išmatuotos ATP sintezės dalis priklauso nuo ATP sintazės. Antra, atlikite žinomo ATP priedo atgavimo bandymą sistemoje be ląstelių, naudodami žinomą ATP kiekį, visą reagentų mišinį ir tiksliai tas dažiklio koncentracijas, kurios naudojamos tyrime: bent 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM ir 2 uM. Dažiklis gali sugerti skleidžiamą šviesą, slopinti signalą generuojantį fermentą arba keisti reagentų redokso chemiją, o bendrosiose luciferazės tyrimų rekomendacijose būtent tokio pobūdžio trukdžiams nustatyti rekomenduojami papildomi biocheminiai kontroliniai tyrimai. Nemanykite, kad esant 1 uM koncentracijai artefaktų nėra vien todėl, kad gesinimas paprastai stipresnis esant didesnėms koncentracijoms.

Membranos potencialo zondai matuoja dažiklio pasiskirstymą, o ne srautą

Safraninas O, TMRM ir TMRE, rodaminas 123 bei JC-1 yra pro membraną prasiskverbiantys katijonai. Pagal elektrocheminę pusiausvyrą jie kaupiasi neigiamai įkrautoje matricoje, todėl bendroji fluorescencija netiesiogiai parodo potencialą per zondo pasiskirstymą. Nė vienas jų nematuoja ATP ar elektronų srauto.

Kiekvienam zondui geriausiai tinka tam tikras preparatas. Safraninas O tinka izoliuotoms mitochondrijoms ir permeabilizuotoms ląstelėms, paprastai naudojant apie 2 uM koncentraciją, sužadinimą ties maždaug 495 nm ir emisiją ties maždaug 585 nm. Jis naudojamas gesinimo režimu, kai zondo kaupimasis keičia bendrąją fluorescenciją. TMRM ir TMRE tinka nepažeistoms ląstelėms, naudojant mažas nanomolines įkrovimo koncentracijas negesinimo režimu: depoliarizacija išlaisvina dažiklį, ir mitochondrijų fluorescencija sumažėja; esant didelėms įkrovimo koncentracijoms, dėl savaiminio gesinimo signalo kryptis gali apsiversti. JC-1 suteikia patogų žalios ir raudonos fluorescencijos santykį, tačiau priklauso nuo įkrovimo ir mitochondrijų masės, todėl kiekybiniams tyrimams yra mažiau tinkamas nei kruopščiai kontroliuojamas TMRM. Šie kompromisai apibendrinti plačiai naudojamoje mitochondrijų membranos potencialo zondų apžvalgoje.

Metileno mėlynasis sukelia optinius trukdžius būtent esant darbinėms koncentracijoms. Jo sugerties juostos ties maždaug 600–665 nm persidengia su raudoną šviesą skleidžiančių zondų emisija, todėl tikėtini vidinio filtro efektai, gesinimas ir sužadinimo šviesos sugertis. Be to, dažiklis yra antras lipofilinis katijonas, kurio pasiskirstymas taip pat kinta priklausomai nuo matuojamo potencialo. Apsisaugoti padeda papildomi matavimai ir tuštieji mėginiai: vien zondas, vien dažiklis, zondas su kiekviena dažiklio koncentracija, visiška depoliarizacija naudojant FCCP kaip nulinę atskaitą ir, idealiu atveju, antras optiškai skirtingas zondas. III komplekso apėjimo tyrime toks precedentas sukurtas pakartojus membranos potencialo atkūrimo matavimus su safraninu O ir TMRM po slopinimo antimicinu bei miksotiazolu ir gavus kokybiškai tokį patį atkūrimą. Vienas optinis indikatorius yra užuomina. Du nepriklausomi indikatoriai – įrodymas.

Trys preparatai, trys skirtingi klausimai

Izoliuotos mitochondrijos, permeabilizuotos ląstelės ir nepažeistos ląstelės nėra tarpusavyje pakeičiami vieno tyrimo jautrumo nustatymai. Tai skirtingi modeliai, veikiantys pagal skirtingus principus.

Izoliuotose mitochondrijose išsaugoma elektronų pernašos grandinė, vidinė membrana ir matricos molekulinė sistema, tačiau pašalinama plazminė membrana, citozolis ir tinklo struktūra. Šis pašalinimas ir yra esmė: substratai, ADP, inhibitoriai ir dažiklio koncentracijos tiksliai apibrėžiami, todėl galima nustatyti konkretų kelią. To kaina – prarandamas natūralus substratų tiekimas, signalizacija ir energijos poreikis.

Permeabilizuotose ląstelėse mitochondrijos lieka didelėje dalyje savo ląstelinės struktūros, tačiau pro pralaidžią plazminę membraną gali patekti iš išorės tiekiami substratai ir ADP. Tai tinkamas įrankis substratų apykaitos kelio sutrikimui nustatyti ląsteliniame kontekste. Per didelė permeabilizacija pažeidžia išorinę membraną, o citozolinė reguliacija prarandama išplovus citozolio komponentus.

Nepažeistos ląstelės išsaugo viską: plazminės membranos barjerą, citozolinius reduktorius, endogeninę substratų pernašą, mitochondrijų tinklą ir ATP poreikį. Jos artimiausios fiziologijai ir labiausiai nutolusios nuo mechanizmo išskyrimo, nes dažiklio patekimas, redukcija ir kaupimasis atskiruose skyriuose lemia veiksmingą mitochondrijas pasiekiančio dažiklio kiekį.

TEGDMA tyrime visi trys lygmenys naudoti tikslingai: izoliuotos smegenų mitochondrijos – dažiklio sukeltam oksidacijos ir potencialo atkūrimui tirti, permeabilizuotos dantų pulpos kamieninės ląstelės – daugiausia pažeidimui susieti su I komplekso vykdoma substratų oksidacija, o nepažeistos kamieninės ląstelės – bendram fiziologiniam 2 uM dažiklio poveikiui slopinamam deguonies suvartojimui įvertinti. Skaitytojams, lyginantiems mitochondrijų rodmenis skirtinguose preparatuose, papildomas aiškinamasis straipsnis apie tai, kaip metileno mėlynasis perneša elektronus kvėpavimo grandinėje, suteikia informacijos apie šį kelią, o metileno mėlynojo kvėpavimo tyrimų skaitymo vadove aptariama koncentracijų ir inhibitorių taikymo logika.

Kontroliniai bandymai, kurių reikia redokso reakcijose aktyviam dažikliui

Redokso cikle dalyvaujančiam junginiui reikia daugiau kontrolinių bandymų nei įprastam inhibitoriui, nes vien dažiklio cheminės reakcijos gali imituoti biologinius procesus.

Atliekant respirometriją, naudokite kamerą tik su buferiu dreifui nustatyti, kamerą su buferiu ir dažikliu be biologinės medžiagos, dažiklį su bet kuriuo tyrime esančiu ekstraląsteliniu reduktoriumi ir tyrimo pabaigoje pridėkite rotenono bei antimicino nemitochondriniam deguonies suvartojimui nepažeistose ląstelėse nustatyti. Atkreipkite dėmesį, kad redukuotas dažiklis vėl oksiduojasi, perduodamas elektronus deguoniui ir sudarydamas vandenilio peroksidą. Todėl tuščiasis mėginys tik su dažikliu, bet be elektronų donoro, nuvertina deguonies suvartojimą sistemoje be ląstelių, kuris atsiranda, kai yra NADH ar NADPH.

Vandenilio peroksidui matuoti verčiau rinkitės kalibruotą „Amplex UltraRed“ su krienų peroksidaze, o ne neselektyvius DCFDA dažiklius, patikrinkite rezultatus katalaze ir ištirkite priklausomybę nuo apšvietimo, nes dažiklis yra fotosensibilizatorius. Smegenų mitochondrijų tyrime nustatyta, kad vos 100 nM dažiklio padidino peroksido apkrovą daugiau nei keturis kartus, o jo pašalinimas sulėtėjo; peroksidas susidarė tiesiogiai iš redukuoto dažiklio, be tarpinio superoksido susidarymo. Zondų pasirinkimo ir apšvietimo kontrolės detalės aptariamos papildomame straipsnyje apie reaktyviųjų deguonies formų matavimą eksperimentuose su dažikliais, o platesnis klausimas, kada peroksidas veikia kaip signalas, o kada tampa apkrova, nagrinėjamas kartu su ląstelių redokso pusiausvyra ir teiginiais apie antioksidantus.

Norėdami pagrįsti teiginius apie pernašos kelią, patikrinkite abi III komplekso inhibitorių prisijungimo vietas: antimiciną A Qi vietoje ir miksotiazolą Qo vietoje, taip pat galutinį etapą ties IV kompleksu, naudodami cianidą. Ankstesniame pelių smegenų tyrime nustatyta, kad dažiklis atkūrė rotenonu blokuotą, bet ne antimicinu blokuotą kvėpavimą, o vėlesniame trijų rūšių tyrime nustatytas dalinis atkūrimas su abiem inhibitoriais ir gauta tiesioginės citochromo c redukcijos įrodymų. Apėjimo mechanizmą vertinkite kaip suderinamą su naujesniais duomenimis, o ne galutinai nustatytą, nes dažiklio koncentracija, inhibitoriaus veikimo vieta, substratų sąlygos ir dažiklio pasiskirstymas keičia stebimą kelią.

Tyrimų parinkimo matrica

Naudokite šią lentelę matavimui parinkti pagal klausimą, o ne atvirkščiai.

Minimaliai įtikinamam teiginiui reikia tomis pačiomis dažiklio koncentracijomis – 100 nM, 300 nM, 1 uM ir 2 uM – išmatuoti deguonies srautą protonų nuotėkio sąlygomis, esant ADP, oligomicinui ir atskyrikliui, ATP sintezės greitį, membranos potencialą, pageidautina dviem zondais, ir kalibruotą peroksido išsiskyrimą, naudojant katalazę bei kontrolinius mėginius be ląstelių. Pateikite susietą rodiklių rinkinį: deguonies srautą, ATP sintezės greitį, ATP ir deguonies santykį, potencialą ir peroksidą. Bet kuris vienas iš šių skaičių atskirai yra matavimas, kurio prasmę dar reikia nustatyti.