Kodėl metileno mėlynasis naudojamas kaip kontrastinis dažiklis dažant rūgštims atsparias bakterijas

Laboratorijos darbuotojas apžiūri skreplių tepinėlį, atlikęs visą dažymo procedūrą. Mėlyname fone išsiskiria raudonos lazdelės, o tyrimo išvadoje nurodoma, kad pastebėta rūgštims atsparių bacilų. Kitą dieną kitame preparate matomas vienodas mėlynas laukas be raudonų lazdelių, ir rezultatas pateikiamas kaip neigiamas tuberkuliozės tyrimas. Vienoje iš šių išvadų teigiama daugiau, nei leidžia spręsti preparatas, ir tai ne pirmoji išvada.

Painiojamos pačios sąvokos. Darbuotojas mėlyną dažiklį laikė aptikimo cheminio proceso dalimi, tarsi metileno mėlynasis padėtų aptikti mikobakterijas. Jis to nedaro. Kai metileno mėlynasis patenka ant objektinio stiklelio, pats bandymas jau būna pasibaigęs. Dažiklis tik nudažo foną, kad rezultatą būtų galima įvertinti. Šiame straipsnyje paaiškinama metileno mėlynojo paskirtis dažant rūgštims atsparias bakterijas, kodėl pasirenkama mėlyna, o ne kita spalva ir kokias išvadas leidžia daryti raudonos struktūros mėlyname fone.

Trumpas atsakymas

Rūgštims atsparių bakterijų dažymas yra diferencinis bandymas, pagrįstas trimis principais. Karbolfuksinas, pagrindinis dažiklis, priverstinai įvedamas į visas ląsteles, įskaitant mikobakterijas su vaškiniu apvalkalu. Rūgštinis alkoholis, blukinimo reagentas, pašalina raudoną dažiklį iš įprastų ląstelių, tačiau jo neištraukia iš rūgštims atsparių ląstelių. Tuomet metileno mėlynasis, kontrastinis dažiklis, nudažo viską, iš ko blukinimo reagentas pašalino dažiklį, todėl rūgštims neatsparios ląstelės, šeimininko ląstelės ir liekanos atrodo mėlynos, o rūgštims atsparios bacilos lieka raudonos. Kontrastinis dažiklis suteikia kontrastą. Jis nedalyvauja cheminiuose procesuose, dėl kurių ląstelė yra atspari rūgštims.

Ką atlieka kiekvienas etapas

Toliau pateikta schema rodo, kaip pasiskirsto atskirų etapų funkcijos. Skaitykite ją iš kairės į dešinę kaip procedūrą, o apatinę juostą – kaip priminimą, kad kiekviena dažymo metodų grupė atsako į skirtingą klausimą.

Pirmiausia vyksta prasiskverbimas. Mikobakterijos priešinasi įprastiems vandeniniams dažikliams, nes jų apvalkalas yra itin hidrofobiškas, todėl protokole numatomas priverstinis dažiklio patekimas. Taikant Ziehl–Neelsen metodą, kaitinimas iki garavimo padeda fenolio turinčiam karbolfuksinui prasiskverbti pro vaškinę sienelę. Taikant šaltąjį Kinyoun metodą, kaitinimą pakeičia gerokai stipresnė pagrindinio dažiklio sudėtis, o kai kuriose modifikuotose versijose be kaitinimo pridedama paviršinio aktyvumo medžiagų. Amerikos mikrobiologijos draugijos rūgštims atsparių bakterijų dažymo protokoluose abi sudėtys pateikiamos greta, o koncentracijų skirtumas akivaizdus: maždaug 0.3 g bazinio fuksino 100 mL taikant kaitinamąjį metodą ir apie 4 g taikant šaltąjį metodą.

Antrasis etapas – diferenciacija. Rūgštinis alkoholis, dažniausiai 3 mL koncentruotos druskos rūgšties 97 mL 95 procentų etanolio, išplauna raudoną dažiklį iš visų ląstelių, kurių sienelė nesuteikia ypatingo atsparumo. Ląstelės su nepažeistu mikobakterijų lipidiniu apvalkalu dažiklį išlaiko. Nuo šio etapo priklauso visas metodas, ir jis jautriausias atlikimo technikai, kaip aptariama toliau.

Paskutinis etapas – kontrastas. Dabar preparate matomos raudonos rūgštims atsparios ląstelės beveik bespalviame ląstelių, iš kurių pašalintas dažiklis, fone. 0.3 procento w/v metileno mėlynasis vėl padaro šį foną matomą, suteikdamas jam nuo raudonos kuo labiau besiskiriančią spalvą. Kontrastinis dažymas trunka trumpai, paprastai nuo 20 iki 30 sekundžių taikant kaitinamąjį metodą ir iki kelių minučių taikant kai kuriuos šaltojo metodo variantus; trukmė priklauso nuo protokolo, o ne nuo paties dažiklio savybių.

Kodėl šis dažiklis ir kodėl mėlynas

Metileno mėlynasis yra katijoninis bazinis dažiklis: jo spalvotasis jonas turi teigiamą krūvį ir jungiasi prie neigiamai įkrautų išblukintų bakterijų, šeimininko ląstelių ir liekanų paviršių. „OpenStax“ mikrobiologijos vadovėlyje ši krūvių sąveika aprašoma kaip bendras bazinių dažiklių veikimo principas. Tačiau metileno mėlynasis šiuo požiūriu nėra chemiškai unikalus. Kristalvioletas ir safraninas taip pat yra baziniai dažikliai. Pasirinkimą lemia optika, o ne chemija.

Raudonoms lazdelėms reikia kontrastingo atspalvio fono, o mėlyna spalva sudaro su raudona ypač tinkamą kontrastą šviesiojo lauko mikroskopijai. Safraninas būtų prastas kontrastinis dažiklis, nes jo galutinė rausvai raudona spalva pernelyg panaši į išlaikyto karbolfuksino spalvą ir panaikintų patį procedūros sukurtą skirtumą. Kristalvioletas suteiktų tamsiai violetinį foną, kuris konkuruotų su plonomis raudonomis bacilomis dėl stebėtojo dėmesio. Stipriausias įrodymas, kad šio dažiklio paskirtis yra kontrastas, o ne cheminis poveikis, – galimybė jį pakeisti: kai kuriuose veterinariniuose ir modifikuotuose protokoluose naudojami žali kontrastiniai dažikliai, pavyzdžiui, malachito žaliasis ir briliantinis žaliasis, ir bandymas vis tiek veikia, nes bet kuris aiškiai besiskiriantis atspalvis atlieka tą pačią funkciją.

Iš to kyla dvi praktinės išvados. Pirma, standartinėje receptūroje pH koregavimas nenumatytas; nepainiokite šio paprasto vandeninio 0.3 procento tirpalo su šarminėmis sudėtimis, tokiomis kaip Loefflerio metileno mėlynasis, kurios priklauso kitai dažymo koncepcijai. Antra, per didelis intensyvumas kenkia. Histologijos literatūroje aiškiai įspėjama, kad pernelyg tankus mėlynas fonas gali paslėpti negausias bacilas, todėl laikant preparatą užlietą ilgiau, nei leidžia protokolas, prarandamas aiškumas ir nieko nelaimima.

Sienelės chemija, leidžianti atlikti šį bandymą

Rūgštinis alkoholis diferencijuoja ląsteles dėl mikobakterijų apvalkalo savybių. Jo struktūrinį pagrindą sudaro mikolil-arabinogalaktano-peptidoglikano kompleksas: peptidoglikanas, sujungtas su arabinogalaktanu, prie kurio išorinių galų prijungtos labai ilgų grandinių mikolio rūgštys, sudarančios lipidų gausią išorinę mikomembraną, pasižyminčią itin mažu pralaidumu. Mikobakterijų išorinės membranos apžvalgoje ši sandara išsamiai aprašoma. Barjeras veikia abiem kryptimis. Jis trukdo dažikliui patekti, todėl prasiskverbimui reikia kaitinimo arba stipresnio pagrindinio dažiklio, ir trukdo dažiklį pašalinti, todėl rūgštinis alkoholis nepašalina karbolfuksino, kai šis jau yra viduje. Įprastos bakterijos tokio apvalkalo neturi ir dažiklį praranda. Taigi atsparumą rūgštims geriausia suprasti kaip lipidinio barjero reiškinį, o ne kaip cheminį fuksino jungimąsi prie mikolio rūgšties.

Ši chemija taip pat paaiškina dažną mįslę: Gramo metodu mikobakterijos nusidažo prastai ir nenuspėjamai, kartais atrodo kaip blankios karoliukų pavidalo struktūros arba nenusidažę ląstelių šešėliai. Jų hidrofobinė sienelė riboja kristalvioleto prasiskverbimą. Rūgštims atsparių bakterijų dažymas nėra modifikuotas Gramo dažymas. Tai kitas diferencijavimo principas, pagrįstas kita sienelės savybe, kaip kitų dviejų metodų atveju parodyta paprastojo dažymo ir Gramo dažymo palyginime.

Trys metodai, trys klausimai

Apie platesnę bakterijų dažymo vienu dažikliu metodų grupę skaitykite mikroskopinio dažymo atlase.

Ko raudona spalva mėlyname fone negali įrodyti

Raudonos lazdelės reiškia, kad organizmai išlaikė karbolfuksiną veikiant rūgštiniu alkoholiu. Toks radinys dera su Mycobacterium tuberculosis, tačiau CDC tuberkuliozės diagnostikos gairėse aiškiai pažymima, kad kitos mikobakterijos taip pat yra atsparios rūgštims, todėl rūšiai identifikuoti reikia pasėlio ir nukleorūgščių tyrimų, o ne spalvos.

Atlikimo klaidos dažniausiai susijusios su dviem plovimo etapais. Nepakankamas blukinimas palieka fono medžiagą raudoną ir skatina klaidingai teigiamą interpretavimą. Per stiprus blukinimas pašalina silpnai išlaikomą pagrindinį dažiklį ir prisideda prie klaidingai neigiamų rezultatų. Per intensyvus kontrastinis dažymas paslepia negausias bacilas mėlyname fone. Stori tepinėliai, iškritusios reagentų nuosėdos ir užterštas plovimo vanduo sukuria papildomų artefaktų.

Jautrumą riboja organizmų kiekis, kad ir kaip tiksliai būtų atliekama procedūra. Įprastinei tepinėlio mikroskopijai reikia maždaug nuo 5,000 iki 10,000 bacilų viename mililitre skreplių, o ankstesnėse CDC įrodymų apžvalgose tepinėlio jautrumas pasėliu patvirtintais plaučių tuberkuliozės atvejais buvo maždaug nuo 45 iki 80 procentų. Todėl neigiamas tepinėlio rezultatas niekada neatmeta tuberkuliozės. Dabartinėse CDC gairėse kiekvieną tepinėlio tyrimą numatoma papildyti pasėliu ir rekomenduojama atlikti nukleorūgščių amplifikacijos tyrimą bent vienam kvėpavimo takų mėginiui, kai svarstoma plaučių tuberkuliozės galimybė ir rezultatas pakeistų tolesnę paciento priežiūros taktiką.

Praktinis darbas turi remtis patvirtintais protokolais

Mokomieji aprašymai, įskaitant šį straipsnį, nesuteikia leidimo atlikti klinikinį darbą. Praktiniame laboratorijos darbe vadovaukitės laboratorijos validuota standartine veiklos procedūra, suderinta su dabartiniais CDC, APHL arba CLSI dokumentais; CDC rūgštims atsparių bakterijų dažymo metodinė medžiaga, saugoma „Stacks“ archyve, parodo, kaip tokiose procedūrose apibrėžiami reagentai ir rezultatų vertinimas. Darbui su tuberkuliozės mėginiais būtinos izoliavimo priemonės: tepinėliai ruošiami biologinės saugos spintoje, nes ruošiant susidaro aerozolių ir purslų, o CDC laboratorijų saugos gairėse nurodoma, kad net karščiu fiksuotuose tepinėliuose gali būti gyvybingų tuberkuliozės bacilų ir su jais vis tiek reikia elgtis kaip su užterštais. CDC visuomenės sveikatos vaizdų bibliotekos įrašas apie karbolfuksinu ir metileno mėlynuoju dažytą tepinėlį, tirtą ieškant M. leprae, naudingai primena, kad metodas taikomas ne tik tuberkuliozei: tas pats raudonos ir mėlynos spalvų kontrastas padeda visur, kur ieškoma rūgštims atsparių organizmų, o kruopščiai įvertintas neigiamas radinys pats savaime yra vertas užregistruoti rezultatas.

Nudažyto preparato vertinimas

Kontrastinis dažiklis pasiteisina atliekant pirminę peržiūrą. Mikroskopuotojas, apžiūrėdamas preparatą nedideliu didinimu, pirmiausia pagal mėlyną foną vertina tepinėlio kokybę: ar ląstelės pasiskirsčiusios tolygiai, ar yra nepažeistų šeimininko ląstelių fokusavimui, ar nėra gausių nuosėdų. Tuomet galimos raudonos bacilos patraukia dėmesį būtent todėl, kad niekas kitas preparate nėra raudonas. Jos patvirtinamos naudojant aliejinę imersiją: tikrosios bacilos atrodo kaip tikėtinos plonos, kartais šiek tiek išlenktos ar karoliukų pavidalo lazdelės, o ne vienalytės dažiklio liekanos.

Fono dažymas taip pat lemia tyrimo išvados formuluotę. Jei preparate yra raudonų bacilų, nurodoma, kad pastebėta rūgštims atsparių bacilų, dažnai pateikiant pusiau kiekybinį įvertinimą pagal laboratorijos skalę. Jei preparate raudonų organizmų nėra, nurodoma, kad rūgštims atsparių bacilų nepastebėta, bet niekada – kad tuberkuliozės tyrimas neigiamas. Šis skirtumas svarbus, nes mėlynas laukas rodo, kad dažymas pavyko, ląstelės prisijungė kontrastinį dažiklį, o optikos pakako, tačiau nieko nepasako apie organizmus, kurių kiekis nesiekia aptikimo ribos. Mėlynas laukas be raudonų bacilų yra galiojantis preparato tyrimo rezultatas, o ne išvada apie pacientą.

Prisiminkite atskirų etapų funkcijas, ir tyrimo išvadas bus lengva suformuluoti. Karbolfuksinas išryškina galimus radinius. Rūgštinis alkoholis atlieka bandymą. Metileno mėlynasis tik padaro atsakymą įskaitomą: raudona reiškia, kad dažiklis išlaikytas veikiant rūgštimi, mėlyna – kad jis prarastas. Visa kita – rūšis, organizmų kiekis ir klinikinė reikšmė – nustatoma atliekant tyrimus, kurie neapsiriboja šio preparato vertinimu.