Metileno mėlynasis, Nrf2 ir mitochondrijų biogenezė: paaiškinimas

Tekstuose apie metileno mėlynąjį dažnai pasitaiko vienas sakinys: jis aktyvina Nrf2 ir skatina naujų mitochondrijų susidarymą. Sakinys skamba kaip vienas teiginys, tačiau apima dvi skirtingas sąvokas, tirtas skirtingose sistemose ir pagrįstas skirtingų rūšių įrodymais. Pirmoji yra signalinis kelias — jutiklis, įjungiantis apsauginius genus. Antroji yra statybos programa — ląstelė gamina daugiau mitochondrijų komponentų. Signalas gali paskatinti statybą, tačiau parodyti, kad signalas suveikė, nėra tas pats, kas parodyti, kad pastatas iškilo, o parodyti daugiau statybinių medžiagų nėra tas pats, kas parodyti geresnį energijos tiekimą. Šiame straipsnyje šie trys dalykai atskiriami.

Nrf2 samprata: jutiklis, o ne skydas

Nrf2 (su branduoliniu eritroidiniu faktoriumi 2 susijęs faktorius 2) yra transkripcijos faktorius — baltymas, kurio užduotis yra įjungti genus. Ramybės sąlygomis jį citoplazmoje sulaiko jutiklio funkciją atliekantis baltymas Keap1, kuris nuolat perduoda jį ląstelės skaidymo sistemai. Kai oksidantai ar elektrofilai modifikuoja reaktyvius Keap1 cisteinus, skaidymas sustoja. Naujai pagamintas Nrf2 kaupiasi, patenka į branduolį, susijungia su mažaisiais Maf baltymais ir prisijungia prie DNR sekų, vadinamų antioksidacinio atsako elementais. Šis prisijungimas įjungia visą apsauginių genų grupę.

Šio kelio kanoniniai rodikliai yra konkretūs. NQO1 (NAD(P)H chinono dehidrogenazė 1) ir TrxR1 (tioredoksino reduktazė 1) yra vieni patikimiausių Nrf2 taikinių genų. HO-1 (hemo oksigenazė-1) gali būti stipriai indukuojama, tačiau ją veikia ir kiti reguliatoriai. Tokie fermentai kaip SOD ir katalazė yra antioksidacinės sistemos dalis, bet jų kiekį kontroliuoja daugelis transkripcijos faktorių, todėl vien padidėjęs SOD kiekis neįrodo, kad priežastis buvo Nrf2. Arčiausiai paties signalizacijos įvykio esantys įrodymai yra Nrf2 kaupimasis branduolyje, ARE reporterio aktyvacija arba kanoninių taikinių indukcija, kuri išnyksta pašalinus Nrf2. Visa kita — mažesnis oksidantų kiekis, geresnis išgyvenamumas patiriant stresą, didesnis glutationo kiekis — yra tolesnis poveikis, kurį gali sukelti daugelis kelių.

Ankstyviausias metileno mėlynojo rezultatas šioje istorijoje yra artimesnis tos skalės signalizacijos galui. Fibroblastuose, paveiktuose nanomolinės koncentracijos metileno mėlynuoju, nustatytas lėtesnis ląstelių senėjimas, didesnis IV komplekso kiekis, didesnis deguonies suvartojimas ir 2-osios fazės fermentų TrxR1 bei NQO1 indukcija, kaip aprašyta tyrime, pirmą kartą susiejusiame metileno mėlynąjį su mitochondrijų veiklos sustiprėjimu ir ląstelių senėjimo sulėtėjimu. TrxR1 ir NQO1 yra būtent tie kanoniniai Nrf2 taikiniai, kuriuos atidus skaitytojas norėtų matyti. Tačiau tyrimas neparodė paties signalizacijos įvykio: nebuvo matuotas Nrf2 kiekis branduolyje, naudotas ARE reporteris ar kontrolinis modelis su išjungtu Nrf2 genu. Todėl korektiška išvada yra tokia: šioje sistemoje metileno mėlynasis indukuoja žinomus Nrf2 taikinių genus; tai dera su Nrf2 aktyvacija, tačiau neleidžia išskirti Nrf2 kaip priežasties. Taikinio geno indukcija yra vienu žingsniu toliau už patį jungiklį.

Biogenezės samprata: programa su trimis kontroliniais taškais

Mitochondrijų biogenezė yra programa, kuria ląstelė didina savo mitochondrijų pajėgumą. Vadovėliuose aprašoma jos hierarchija apima tris kontrolinius taškus. Pirma, koaktyvatorius PGC-1alpha įjungia programą. Antra, branduoliniai transkripcijos faktoriai (pavadinimai gali klaidinti: vienas jų vadinamas NRF1, branduoliniu kvėpavimo faktoriumi 1, ir tai yra kitas baltymas nei Nrf2) skatina mitochondrijų genų raišką, įskaitant TFAM, kuris palaiko ir replikuoja mitochondrijų DNR. Trečia, ląstelėje atsiranda daugiau mitochondrijų genomų ir kvėpavimo sistemos komponentų; tai galima išmatuoti pagal mtDNA kopijų skaičių, citrato sintazės aktyvumą arba kvėpavimo kompleksų kiekį ir aktyvumą.

Kiekvienas kontrolinis taškas leidžia formuluoti silpnesnį arba stipresnį teiginį nei ankstesnis. Didesnis PGC-1alpha ar TFAM informacinės RNR kiekis rodo, kad programa buvo inicijuota, bet ne tai, kad ji buvo įvykdyta. Daugiau mtDNA ar daugiau IV komplekso baltymo rodo didesnį medžiagos kiekį, tačiau taip pat gali atrodyti ir persitvarkiusios mitochondrijos. Geresnis kvėpavimas, didesnis deguonies suvartojimas ar kompleksų aktyvumas rodo pakitusią funkciją, bet funkcija gali pagerėti net neatsiradus naujų mitochondrijų. Tvirtas teiginys apie biogenezę sujungia visus tris aspektus: reguliatorių, kiekį ir funkciją.

Tolesnis fibroblastų tyrimas apėmė didžiąją šios grandinės dalį. Žmogaus IMR90 ląstelėse, paveiktose 100 nanomolinės koncentracijos metileno mėlynuoju, NAD ir NADH santykis laikinai padidėjo per 15 minučių ir per parą grįžo į pradinį lygį. Po šio trumpalaikio energinės būklės signalo vyko laikinas energijos jutiklio AMPK fosforilinimas, tuomet — PGC-1alpha ir SURF1, baltymo, būtino veikiančiam IV kompleksui surinkti, indukcija. IV komplekso aktyvumas maždaug padvigubėjo, oksidantų kiekis ląstelėse sumažėjo maždaug 28 procentais, o telomerai trumpėjo lėčiau. Visa seka aprašyta straipsnyje, siejančiame metileno mėlynojo redokso aktyvumą su AMPK ir mitochondrijų biogeneze.

Dvi šio straipsnio detalės vertos dėmesio, nes būtent tokios detalės dažnai praleidžiamos. Pirma, aktyvacijos pobūdis buvo svarbesnis už patį jos buvimą: metileno mėlynasis AMPK įjungė laikinai, o palyginamasis vaistas AICAR — nuolat; laikinas aktyvatorius ląstelių senėjimą sulėtino maždaug aštuonis kartus veiksmingiau. Todėl teiginys „metileno mėlynasis aktyvina AMPK“ yra neišsamus; esminis teiginys yra tas, kad jis AMPK aktyvina laikinai, o palyginimas leidžia manyti, kad nuolatinė aktyvacija tokio pat poveikio nesukelia. Antra, metileno mėlynasis nepakeitė ląstelių ciklo, todėl atmetamas paprasčiausias alternatyvus paaiškinimas: kad ląstelės tiesiog dalijosi lėčiau ir dėl to atrodė jaunesnės.

Tyrimai su pelėmis: elgesys, genomai ir sąmoningai paradoksalus pradinis signalas

Ląstelių kultūrų tyrimus į gyvūnų modelį perkėlė grupė, tyrusi vidutinio amžiaus peles. Po 60 dienų geriamojo metileno mėlynojo vartojimo jį gavusios pelės išlaikė daugiau fizinės ištvermės ir tyrinėjimo elgesio bei pasižymėjo silpnesniu į nerimą panašiu elgesiu nei jo negavusios senstančios pelės. Smegenų audinyje genų, kurių raišką senėjimas buvo nuslopinęs — NRF1, TFAM, SOD2 ir IV komplekso subvieneto COX1 — raiška vėl priartėjo prie suaugusių pelių lygio, o mtDNA kopijų skaičius padidėjo. Šie rezultatai, apimantys elgesį, reguliatorius ir genomų kiekį, pateikti vidutinio amžiaus pelių tyrime apie metileno mėlynąjį ir smegenų mitochondrijų biogenezę.

Įdomiausia dalis yra siūlomas pradinis signalas, nes jis prieštarauja paprastam pasakojimui, kad metileno mėlynasis yra antioksidantas. Metileno mėlynąjį gavusių pelių smegenų mitochondrijose padidėjo reaktyviųjų deguonies formų, konkrečiai vandenilio peroksido, susidarymas. Autorių hipotezė: silpnas peroksido signalas aktyvina Nrf2 kelią, o šis tuomet skatina biogenezės programą. Šiame modelyje metileno mėlynasis pradinio signalo etape veikia kaip prooksidantas, o galutinio rezultato etape — kaip antioksidantas. Farmakologai tokį reiškinį vadina hormeze: nedidelis stresas sukelia apsauginį atsaką, stipresnį už patį stresą. Ar tas peroksido padidėjimas iš tiesų sukelia Nrf2 aktyvaciją, tiesiogiai netirta; tai siūlomas jungiamasis ryšys, o ne išmatuota sąsaja.

Papildomame tos pačios grupės tyrime buvo patikrintas šios hipotezės saugumo aspektas. Izoliuotose smegenų mitochondrijose metileno mėlynasis didino vandenilio peroksido gamybą jau esant 50 nanomolinei koncentracijai, tačiau terapinės koncentracijos nesukėlė aptinkamo mitochondrijų DNR pažeidimo. Tik esant 100 mikromolinei koncentracijai, gerokai viršijančiai terapinį lygį, nustatyta pasirinktų mtDNA fragmentų pažeidimų, o 20 mikromolinės koncentracijos dažiklio derinys su raudona šviesa sukūrė singuletinį deguonį, kuris plačiai pažeidė mtDNA. Tai yra žinoma dažiklio fotosensibilizuojamoji savybė, o ne jo farmakologinis veikimas tamsoje. Išankstinis poveikis netgi apsaugojo ventralinės vidurinių smegenų dalies mitochondrijas nuo rotenono sukeltų mtDNA pažeidimų. Atsakas į dozę ir genotoksiškumo kontroliniai bandymai išsamiai aprašyti tyrime apie negenotoksišką metileno mėlynojo sukeliamą peroksido gamybą.

Kas išmatuota, o kas siūloma: kaip skaityti schemą

Toliau pateikta signalinių kelių schema sukurta šiam straipsniui, kad aiškiai išlaikytų tekste daromą skirtį. Langeliai ištisiniais rėmeliais žymi etapus, tiesiogiai pagrįstus eksperimentais metileno mėlynojo tyrimų literatūroje: redokso ciklą, keičiantį NAD/NADH santykį, laikiną AMPK fosforilinimą, PGC-1alpha ir SURF1 indukciją, didesnį IV komplekso aktyvumą, NQO1 ir TrxR1 indukciją, atkurtą biogenezės genų raišką ir mtDNA kopijų skaičių pelių smegenyse bei peroksido kiekio padidėjimą nepažeidžiant mtDNA esant terapinėms dozėms. Langeliai punktyriniais rėmeliais žymi siūlomus ryšius: Keap1 aptinkamą peroksido signalą, apsauginius genus įjungiantį Nrf2 kaupimąsi branduolyje ir priežastinę rodyklę nuo Nrf2 aktyvacijos iki biogenezės programos. Šie punktyru pažymėti etapai yra tikėtini, dera su duomenimis ir atitinka vadovėlinę biologiją, tačiau šiuose straipsniuose jie nebuvo išmatuoti taikant kontrolinius metodus (Nrf2 kiekio branduolyje matavimą, ARE reporterius, Nrf2 geno išjungimą), kurie leistų juos pažymėti ištisiniais rėmeliais.

Žvelgiant į schemą išryškėja trys painiavos šaltiniai. Pirma, NRF1 ir Nrf2 yra skirtingi baltymai, kurių pavadinimai beveik vienodi; pelių tyrime matuotas branduolinis kvėpavimo faktorius 1, biogenezės reguliatorius, o ne antioksidacinis transkripcijos faktorius, ir juos sutapatinus visa schema sutraukiama į vieną mazgą. Antra, genų raiška yra istorijos pradžia, o ne pabaiga; atsikūrę TFAM ar COX1 informacinės RNR kiekiai pagrindžia biogenezės inicijavimą, o mtDNA kopijų skaičius ir IV komplekso aktyvumas yra įrodymai, kad programa buvo įvykdyta. Trečia, antioksidacinis rezultatas neįrodo Nrf2 kelio vaidmens; 28 procentais sumažėjęs oksidantų kiekis fibroblastuose ir apsauga nuo rotenono poveikio pelėms yra tikras tolesnis poveikis, tačiau jį gali lemti keli skirtingi keliai.

Ko reikėtų, kad punktyrinis rėmelis taptų ištisinis

Trūkstami eksperimentai yra įprasti. Nrf2 baltymo kiekio branduolyje matavimas po metileno mėlynojo poveikio, pasirinkus laiko eigą, atitinkančią trumpalaikį AMPK signalą, leistų patikrinti, ar abi šakos iš tiesų aktyvinamos kartu, kaip teigia sinchronizuotos aktyvacijos hipotezė. ARE valdomas reporteris patvirtintų transkripcinį aktyvumą, užuot apie jį sprendus pagal taikinių genus. Pakartojus biogenezės rodiklių matavimus nuslopinus Nrf2 raišką arba išjungus jo geną, būtų galima tiesiogiai patikrinti priežastinę rodyklę: jei IV komplekso indukcija ir mtDNA kiekio padidėjimas išliktų be Nrf2, siūlomas jungiamasis ryšys būtų klaidingas, o poveikį lemtų vien AMPK šaka. Tyrimuose su gyvūnais ilgalaikio dozavimo tyrimas, apimantis tuos pačius tris kontrolinius taškus — reguliatorių, kiekį ir funkciją — leistų patikrinti, ar programa lieka aktyvi, ar prisitaiko. Iki tol sinchronizuota energijos ir apsauginių kelių aktyvacija lieka tuo, kuo ją pavadino autoriai: galimu svarbiu veiksniu, o ne nustatytu mechanizmu.

Skaitytojams, besidomintiems platesne farmakologija, gali prireikti papildomo konteksto: kaip metileno mėlynasis perneša elektronus mitochondrijose, kaip dar jis veikia mitochondrijas ir ląstelių energiją, kokią vietą ląstelių senėjimo rezultatai užima senėjimo tyrimuose, kaip teiginiai apie biogenezę susiję su pažintiniu pajėgumu ir kokie saugumo duomenys apibrėžia kiekvieno pokalbio apie dozavimą ribas. Kiekviena iš šių temų yra atskira sąvoka, turinti savus įrodymus, ir kiekvienai verta taikyti tą pačią išmatuotų rezultatų ir siūlomų hipotezių skirtį, kuri šiame straipsnyje taikyta Nrf2.